16SrRNA在肉毒梭菌分型鉴定中的应用

·１１８６　 · 第二军医大学学报　２０１１年１１月第３２卷第１１期 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｊｓｍｍｕ．ｃｎ Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｏｖ．２０１１，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１１ ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１００８．２０１１．０１１８６ ·论　著· １６ＳｒＲＮＡ在肉毒梭菌分型鉴定中的应用 卢卫嘉，毛晓燕＊，熊　颖，张　超，王建锋 兰州生物制品研究所，兰州７３００４６ 　　［摘要］　目的　建立一种快速、可靠的对肉毒梭菌进行分型鉴定的手段。方法　以从 ＬＣＬ０６３、８３０１１０、ＬＣ１７５、 ＬＣＬ１５５、６６４１８、Ｎ１５３、６１０８２、ＡＬＡＳＫＡ、ＩＷＡＮＡＩ共９株梭菌中提取的基因组ＤＮＡ为模板，利用１６ＳｒＲＮＡ特异性引物分别 进行ＰＣＲ扩增并进行Ｔ－Ａ克隆转化、测序。通过Ｃｌｕｓｔａｌ和 Ｍｅｇａ软件分析１６ＳｒＤＮＡ序列，以ＮＪ法和 ＭＰ法构建进化树， 分析其种属特异性。结果　１６ＳｒＲＮＡ分型结果可判断出ＬＣＬ０６３、８３０１１０、ＬＣＬ１７５为产Ｅ型毒素的酪酸梭菌。ＩＷＡＮＡＩ与 ＡＬＡＳＫＡ株为Ｅ型肉毒梭菌。与传统分型鉴定得到的结果一致。结论　１６ＳｒＲＮＡ在肉毒梭菌分型鉴定中具有快速、准确 的优势，随着核糖体库的不断完善，有望成为细菌分型鉴定的标准依据。 　　［关键词］　１６ＳｒＲＮＡ；肉毒梭菌；进化树；细菌分型技术 　　［中图分类号］　Ｒ　３７２　　　［文献标志码］　Ａ　　　［文章编号］　０２５８－８７９Ｘ（２０１１）１１－１１８６－０３ １６ＳｒＲＮＡ　ｉｎ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＬＵ　Ｗｅｉ－ｊｉａ，ＭＡＯ　Ｘｉａｏ－ｙａｎ＊，ＸＩＯＮＧ　Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈａｏ，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ－ｆｅｎｇ Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００４６，Ｇａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ ［收稿日期］　２０１１－０８－１５　　　　［接受日期］　２０１１－１０－０９ ［作者简介］　卢卫嘉，硕士，助理研究员．Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｋｙ４１６２９５９５＠１６３．ｃｏｍ ＊通信作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ）．Ｔｅｌ：０９３１－８３１６２３０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｏｘｉａｏｙａｎ２００２＠１６３．ｃｏｍ 　　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｒａｐｉｄ，ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｕｓｉｎｇ　１６Ｓ ｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｇｅｎｏｍｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　９ｓｔｒａｉｎｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ＬＣＬ０６３，８３０１１０，ＬＣ１７５，ＬＣＬ１５５，６６４１８，Ｎ１５３，６１０８２，ＡＬＡＳＫＡ，ａｎｄ　ＩＷＡＮＡＩ；１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｅｄ ｂｙ　ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　１６ＳｒＲＮＡ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｔｏ　ｐＧＥＭ －Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　１６ＳｒＤＮＡ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　Ｃｌｕｓｔａｌ　ａｎｄ　Ｍｅｇａｐｒｏｇｒａｍ；ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ Ｎｅｉｇｈｏｒ　ｊｏｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｍａｘｉｍｕｍ　ｐａｒｓｉｍｏｎｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ＬＣＬ０６３，８３０１１０，ａｎｄ　ＬＣＬ１７５ｗｅｒｅ　ＢＯＮＴ／Ｅ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍｓ；ＩＷＡＮＡＩ　ａｎｄ　ＡＬＡＳＫＡ　ｗｅｒｅ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｔｙｐｅ　Ｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　１６ＳｒＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｓ　ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｍａｙ　ｓｅｒｖｅ　ａｓ　ａ　ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ　ｆｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｙｐｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ　ｄａｔａ　ｂａｎｋ． 　　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　１６ＳｒＲＮＡ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｔｙｐｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ［Ａｃａｄ　Ｊ　Ｓｅｃ　Ｍｉｌ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ，２０１１，３２（１１）：１１８６－１１８８］ 　　核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）是生物体蛋白质翻译的重 要组成部分，原核生物含有３种ｒＲＮＡ：５Ｓ、１６Ｓ、 ２３Ｓ，大小分别为１２０、１　５００、３　０００ｂｐ左右。２０世 纪，研究者们在对生物进行编目的工作中发现：１６Ｓ ｒＲＮＡ及其类似的ｒＲＮＡ作为生物系统发育指标最 为合适［１］。其主要具有以下几点优势：（１）所有细胞 共有；（２）功能同源；（３）既有可变序列又有保守序 列；（４）分子大小适宜操作；（５）序列的变化与进化距 离相适宜。随着近年来网络资源的不断丰富，核糖 体数据库也日益完善，将未知菌株的１６ＳｒＲＮＡ通 过生物信息学的方法进行比对并分型鉴定的技术也 越来越受到人们的重视［２－４］。 　　本研究对梭菌保藏中心（国家级菌种保藏中心） 的９株梭菌提取了基因组ＤＮＡ，设计合成了梭菌特 异性的１６ＳｒＲＮＡ引物对，通过ＰＣＲ扩增出９株菌 株的１６ＳｒＤＮＡ并测序，将测序结果使用Ｃｌｕｓｔａｌ和 Ｍｅｇａ软件构建系统进化树分析其种属特异性并与 传统分型鉴定方法做对比。 １　 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 １．１　 菌 株 与 试 剂 　ＬＣＬ０６３、８３０１１０、ＬＣ１７５、 ＬＣＬ１５５、６６４１８、Ｎ１５３、６１０８２、ＡＬＡＳＫＡ、ＩＷＡＮＡＩ 等９株梭菌由兰州生物制品研究所梭菌专业实验室 提供，梭菌专用培养液由实验室自行配制；ＤＨ５α菌 第１１期．卢卫嘉，等．１６ＳｒＲＮＡ在肉毒梭菌分型鉴定中的应用 ·１１８７　 · 株购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。 　　ＬＡ　Ｔａｑ酶购自ＴａＫａＲａ公司，ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ 购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；ＳＤＳ、蛋白酶 Ｋ 购自Ｓｉｇｍａ公 司。ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液、氯仿：异戊醇（２４１）、酚 氯仿异戊醇（２５２４１）、异丙醇、７０％乙醇、Ｔｒｉｓ －ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＮａＣｌ等均为国产试剂。 　　引物合成、序列测定由上海生工生物工程服务 技术有限公司完成。 １．２　细菌培养　使用梭菌专用培养液对９株梭菌 ３０℃厌氧培养４８ｈ。 １．３　细菌基因组ＤＮＡ的提取　１００ｍｌ细菌过夜 培养液，５　０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，去上清液。加９．５ ｍｌ　ＴＥ悬浮沉淀，并加０．５ｍｌ　１０％ＳＤＳ、５０μｌ　２０ ｍｇ／ｍｌ蛋白酶 Ｋ，混匀，３７℃保温１ｈ。加１．５ｍｌ　５ ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，混匀。加１．５ｍｌ　ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液， 混匀，６５℃保温２０ｍｉｎ。用等体积酚氯仿异戊 醇（２５２４１）抽提，５　０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，将上清 液移至干净离心管。用等体积氯仿异戊醇（２４ １）抽提，取上清液移至干净管中。加１倍体积异丙 醇，颠倒混合，室温下静置１０ｍｉｎ，沉淀 ＤＮＡ。 ５　０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，小心弃去上清，超净台风干 管内残余液体，７０％乙醇漂洗后，吸干，溶解于１ｍｌ ＴＥ，－２０℃保存。 １．４　ＰＣＲ扩增１６ＳｒＤＮＡ 序列　分别以得到的细 菌基因组ＤＮＡ为模板，采用针对绝大部分细菌的上 游引物Ｆ１（序列为５′－ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＴＧＧ ＣＴＣ　ＡＧ－３′；８－２７）和梭菌特异性的下游引物Ｒ４ （序列为５′－ ＡＣＧ　ＧＡＴ　ＡＣＣ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＣＧＡ ＣＴＴ－３′；１５１２－１４９２）［５－６］，以ＴａＫａＲａ公司的ＬＡ Ｔａｑ酶ＰＣＲ扩增得到１６ＳｒＤＮＡ序列。ＰＣＲ反应 条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ， ７２℃１５０ｓ，共２０个循环；７２℃再延伸１０ｍｉｎ。 １．５　Ｔ－Ａ克隆　将９条１６ＳｒＤＮＡ序列克隆入 ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ载体中，按《分子克隆实验指南》［７］ 操作转化入ＤＨ５α菌株，培养皿划线培养后挑取单 克隆，测序。 １．６　系统进化树分析　从ＧｅｎＢａｎｋ已公布序列中 随机挑选肉毒梭菌 Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型以及酪酸梭菌１６Ｓ ｒＤＮＡ的基因序列各１条，分别命名为ＢＯＮＴ　Ａ、 ＢＯＮＴ　Ｂ、ＢＯＮＴ　Ｅ、ＢＯＮＴ　Ｆ、ＮＣＩＭＢ８０８２。以耶尔 森鼠疫杆菌（ＢＺＧＬ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的１６Ｓ ｒＤＮＡ作为２个对照外群，与１．５项下测序正确的９ 条１６ＳｒＤＮＡ序列一起，构建系统进化树。首先使 用Ｃｌｕｓｔａｌ软件将１５条序列进行完全比对，然后分 别用程序提供的邻接法（ＮＪ）和最大简约法（ＭＰ）计 算序列的进化距离；将得到的结果使用 Ｍｅｇａ程序 构建系统进化树，数据自展重抽样次数为１　０００次。 ２　结　果 ２．１　ＰＣＲ扩增１６ＳｒＤＮＡ 序列　ＰＣＲ扩增产物行 １％琼脂糖凝胶电泳，结果见图１。 图１　９株梭菌ｒＲＮＡ　ＰＣＲ产物１％凝胶电泳图 Ｆｉｇ　１　１％ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｒＲＮＡ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ １：ＬＣＬ０６３；２：８３０１１０；３：ＬＣ１７５；４：ＬＣＬ１５５；５：６６４１８；６：Ｎ１５３；７：６１０８２；８：ＡＬＡＳＫＡ；９：ＩＷＡＮＡＩ；Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ ２．２　系统进化树分析　构建的系统进化树如图２、 ３所示，可以看出，菌株ＬＣＬ０６３、８３０１１０、ＬＣＬ１７５、 ＬＣＬ１５５的进化距离较近，且此４株菌株与 Ｇｅｎ－ Ｂａｎｋ上公布的１株酪酸梭菌ＮＣＩＭＢ８０８２处于同一 个分支下，故可判断此５株细菌在进化谱系上具有 较近的亲缘关系。ＩＷＡＮＡＩ、ＡＬＡＳＫＡ与ＧｅｎＢａｎｋ 上公布的Ｅ型肉毒菌株Ｅ３株的亲缘关系也较高。 根据本科室的梭菌菌种保藏 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 以及对此９株菌株 所做的生化鉴定以及形态学分析，ＬＣＬ０６３、８３０１１０、 ＬＣＬ１７５为产生Ｅ型肉毒毒素的酪酸梭菌，ＬＣＬ１５５ 为我们已经鉴定证实的１株酪酸梭菌［８］。ＩＷＡＮＡＩ 与ＡＬＡＳＫＡ株为Ｅ型肉毒梭菌，这与进化树所展 示出的结果相一致。 ·１１８８　 · 第二军医大学学报　２０１１年１１月，第３２卷 图２　邻接法构建系统进化树 Ｆｉｇ　２　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｎｅｉｇｈｏｒ　ｊｏｉｎｉｎｇ 图３　最大简约法构建系统进化树 Ｆｉｇ　３　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｍａｘｉｍｕｍ　ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ３　讨　论 　　构建系统进化树的方法主要有距离法、简约法、 似然法，以及贝叶斯推断的统计学方法。当所考虑 的谱系间进化速率可变时，距离法中的 ＮＪ法特别 适用。ＮＪ法能给出枝长最小平方估计的序列，即能 最真实地反映序列间的真实距离。ＮＪ法有６种计 算方法，通常选择ｐ－ｄｉｓｔａｎｃｅ。ＭＰ法在序列非常 相似以及序列数目较小的情形下较适用［９］。 　　随着核糖体 ＲＮＡ 库的日益完善，根据１６Ｓ ｒＲＮＡ序列构建进化树并以此作为细菌分型的依据 已经被广泛使用。本研究所选择的９株菌株中， ＬＣＬ０６３、８３０１１０、ＬＣＬ１７５是能产生Ｅ型肉毒毒素 的酪酸梭菌，且在生化及形态学上与Ｅ型肉毒梭菌 很难区别，需要专业人员大量的经验积累，这曾一度 给本实验室造成了困扰。但是从本研究结果中可以 很清楚地判定此３株菌的种属特异性。 　　目前传统的肉毒菌株鉴定需要生化及形态学的 方法以及血清型试验，且耗时较长（有时需要１～２ ｄ，甚至更长的时间），并且需要大量的动物实验验 证，具有一定的人为主观性以及不确定性，这就需要 工作人员有相对丰富的工作经验以及实验技能。 １６ＳｒＲＮＡ在肉毒梭菌的分型鉴定中，具有高效、快 速、客观性强的优点，如果将构建ＴＡ克隆测序的阶 段改为指纹图谱酶切，那么整个试验的操作时间将 以小时计算，这在对于肉毒中毒的临床治疗以及突 发事件的快速处理上将具有无可比拟的优势。 　　目前，一些研究结构建立了专门用于核糖体序列 分析的数据库，其中最著名的是美国密歇根州立大学 的ＲＤＰ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ＲＤＰ／）， 该数据库目前包括了１　４８３　０１６多个细菌及古细菌的 小亚单位ｒＲＮＡ序列，并且还在不断的丰富中。 　　随着相关数据库的不断完善以及生物信息学软 件的不断进步，基于１６ＳｒＲＮＡ为基础的细菌分型鉴 定工作将成为细菌分型鉴定中越来越重要的依据。 ［参 考 文 献］ ［１］　Ｏｌｓｅｎ　Ｇ　Ｊ，Ｗｏｅｓｅ　Ｃ　Ｒ．Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ：ａ　ｋｅｙ　ｔｏ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ［Ｊ］．Ｊ　ＦＡＳＥＢ，１９９３，７：１１３－１２３． ［２］　Ｗａｎｇ　Ｘ，Ｈｏｅｆｅｌ　Ｄ，Ｓａｉｎｔ　Ｃ　Ｐ，Ｍｏｎｉｓ　Ｐ　Ｔ，Ｊｉｎ　Ｂ．Ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｒｏｍ ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｌｕｄｇｅ［Ｊ］．Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，１０３：１４１５－１４２３． ［３］　Ｙａｎｇ　Ｍ　Ｘ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ　Ｂ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｄｅｃａｙｉｎｇ ｍａｉｚｅ　ｓｔａｌｋｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００７，４５：３６７－３７０． ［４］　Ｒｕｄｉ　Ｋ，Ｚｉｍｏｎｊａ　Ｍ，Ｋｖｅｎｓｈａｇｅｎ　Ｂ，Ｒｕｇｔｖｅｉｔ　Ｊ，Ｍｉｄｔｖｅｄｔ　Ｔ， ＥｇｇｅｓｂＭ．Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ａ　ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎ－ ｓｉｏｎａｌ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｓｐａｃｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，７３：２７２７－２７３４． ［５］　周　煌．１６ＳｒＲＮＡ序列分析法在医学微生物鉴定中的作用 ［Ｊ］．生物技术通讯，１９９９，１０：２９７－３０５． ［６］　Ｗｅｉｓｂｕｒｇ　Ｗ　Ｇ，Ｂａｒｎｓ　Ｓ　Ｍ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ　Ｄ　Ａ，Ｌａｎｅ　Ｄ　Ｊ．１６Ｓｒｉｂｏｓｏ－ ｍａｌ　ＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９１，１７３：６９７－７０３． ［７］　萨姆布鲁克Ｊ，弗里奇Ｅ　Ｆ，曼尼阿蒂斯 Ｔ．分子克隆实验指南 ［Ｍ］．黄培堂　译．２版．北京：科学出版社，１９９２：４９－５６． ［８］　Ｍｅｎｇ　Ｘ，Ｋａｒａｓａｗａ　Ｔ，Ｚｏｕ　Ｋ，Ｋｕａｎｇ　Ｘ，Ｗａｎｇ　Ｘ，Ｌｕ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃ－ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍｓｔｒａｉｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｏｏｄ　ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ　ｉｎ　ａｎ　ｏｕｔｂｒｅａｋ　ｏｆ　ｆｏｏｄ－ｂｏｒｎｅ　ｔｙｐｅ　Ｅ　ｂｏｔｕ－ ｌｉｓｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，３５：２１６０－２１６２． ［９］　李　涛，赖旭龙，钟　扬．利用 ＤＮＡ 序列构建系统树的方法 ［Ｊ］．遗传，２００４，２６：２０５－２１０． ［本文编辑］　商素芳