转化生长因子β1 mRNA在实验性肝癌间质差异形成2000

PAGE 2 摘　要：目的：应用原位分子杂交技术观察了ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ在实验性大鼠胆管细胞性肝癌（ＣＣ）和肝细胞 性肝癌（ＨＣＣ）中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达，探讨肝癌间质差异形成的可能机制。方法：大鼠肝癌组织经ＨＥ和Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ染色确认ＣＣ或ＨＣＣ，用ＴＧＦ－β１反应ＲＮＡ探针检测ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ的表达，同时以ＴＧＦ－β１正链，β－ｍＲＮＡ呈弱到中等强度的表 达，少数ＣＣ的间质细胞也有ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ表达。 临床与实验病理学杂志 CHINESE JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL PATHOLOGY 2000　Vol.16　No.4　P.313-315 转化生长因子β1 mRNA在实验性肝癌间质差异形成中的意义 朱蕾　路建平　朱世能　林肇辉　野村慎太郎 摘要　目的:应用原位分子杂交技术观察TGF-β1 mRNA在实验性大鼠胆管细胞性肝癌（CC）和肝细胞性肝癌（HCC）中的表达，探讨肝癌间质差异形成的可能机制。方法:大鼠肝癌组织经HE和Alcian Blue染色确认CC 或HCC，用TGF-β1反义RNA探针检测TGF-β1 mRNA的表达，同时以TGF-β1正链,β-actin反义RNA探针分别作为阴性和阳性对照。 结果:CC中多数癌细胞内TGF-β1 mRNA有较强表达，HCC中仅少部分癌细胞胞浆内TGF-β1 mRNA呈弱到中等强度的表达；少数CC的间质细胞也有TGF-β1 mRNA表达。结论:由于TGF-β1是促进间质形成的重要因子，因此CC癌细胞及间质细胞合成并分泌的TGF-β1可能是CC间质多于HCC间质的原因。 关键词　肝肿瘤，实验性; 原位杂交; 转化生长因子β；大鼠 中图文章编号　1001-7399(2000)04-0313-03 Significance of transforming growth factor β1 mRNA expression in the formation of stroma difference in experimental rat liver cancer Zhu Lei (Dept of Pathol, Shibei Hospital of Zhabei District, Shanghai　200435） Lu Jianping, Zhu Shineng，Lin Zhaohui （Dept of Pathol, Shanghai Medical University　200032) Sintaro Nomura ABSTRACT　Purpose　To clarify the role of TGF-β1 mRNA in the formation of the liver cancer stroma difference between cholangiocarcinoma(CC) and hepatocellular carcinoma(HCC), the expression of TGF-β1 mRNA was examined with in situ hybridization in experimental rat HCC and CC. Methods　HCC and CC were confirmed by HE and Alcian Blue staining. TGF-β1 antisense probe was used to show the expression of TGF1 mRNA in the above samples. TGF-β1 sense and β-actin antisense probes were used as negative and positive controls separately. Results　In CC, most cancer cells expressed TGF-β1 mRNA intensively, while, in HCC, only a small part of the cancer cells expressed TGF-β1 mRNA in the cytoplasm with weak to moderate positivity. TGF-β1 mRNA was also detected in small part of the cancer stroma cells of CC, but not in HCC. Conclusion　TGF-β1 is an important factor in promoting stroma formation, the stronger TGF-β1 expression in CC than HCC may be one of the cause in the stroma difference. KEY WORDS　liver neoplasms,experimental;in situ hybridization;transforming growth factor beta;rats 　 　对人体胆管细胞性肝癌(CC)和肝细胞性肝癌(HCC)的比较研究表明CC间质明显多于HCC者，CC中肌纤维母细胞也明显增多，提示肌纤维母细胞在肝 癌间质形成中的可能作用〔1〕。在大鼠实验性肝癌的研究中也有同样发现，且间质中结蛋白（Dm）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性细胞的分布与胶原 Ⅰ、Ⅲ（ColⅠ、ColⅢ）的沉积一致〔2〕，证实了上述推论。但有关肌纤维母细胞在CC中多于HCC的机制尚不清楚。 　　TGF-β1在体外可调节人成纤维细胞细胞外基质(包括I型前胶原mRNA，纤维连接蛋白mRNA)的表达〔3〕，是调节细胞外基质沉积的一个强有力的细胞因子。本研究以TGF-β1为指标，观察TGF-β1 mRNA在实验性HCC和CC中的表达，探讨其对肝癌间质中肌纤维母细胞的可能作用及最终在肝癌间质差异产生中的意义。 1　材料与方法 1.1　标本　Wistar雄性大鼠，131±6.1 g，80只（上海医科大学实验动物部提供），随机分成对照组和诱癌组。将0.05% 3�-Me-DAB(日本东京化成株式会社产品)拌入纯玉米粉喂养诱癌组大鼠12周，对照组喂以纯玉米粉，其后改用普通混合饲料。第12、16周时分别处死诱癌组大鼠15只和对照组大鼠5只，其余大鼠于第20周时全部处死，取出肝组织，OCT包埋，-70℃保存，6～8 μm厚冷冻连续切片。HCC、CC和混合性肝癌诊断参照路建平等 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 〔4〕 。有关混合性肝癌TGF-β1 mRNA表达情况分别按CC区和HCC区观察记载。孕18天Wistar雌性大鼠于麻醉下取出鼠胎8只，OCT包埋，-70℃保存，制备6～8 μm厚冷冻连续切片作为阳性对照。 1.2　探针的制备　用TGF-β1反义RNA探针检测TGF-β1 mRNA在上述标本的表达。以TGF-β1正链、β-actin反义RNA探针分别作为阴性和阳性对照，地高辛(Dig) RNA标记和检测试剂盒均购自BOEHRINGER MANNHEIM公司。大鼠TGF-β1质粒由NCI Suwen Qian博士提供。载体为pBluescript KS(+)，长度2.96 kb。插入片段:大鼠TGF-β1 cDNA (partial),长度985bp。质粒经转化、培养、抽提、纯化、线性化后，作为探针标记的 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 。用体外转录法标记RNA探针。β-actin反义 RNA探针的标记模板为PCR产物，由上海市计划生育研究所张翔、孙志达提供，PCR引物根据参考文献设计,其上下游引物分别含T3、T7启动子序列 〔5〕。 1.3　原位杂交　主要步骤包括组织切片的杂交前预处理、杂交、杂交后洗涤、抗体反应、发色反应(NBT+BCIP)等,最后用甲基绿复染。抗Dig抗体、NBT、BCIP均购自Boehringer Mannheim公司。 1.4　原位杂交结果判定　阴性(-)：染色与背景相同；弱阳性(+)：浅紫黄色；中等阳性(++)：紫色；强阳性(+++)：深紫色；极强阳性(++++)：紫黑色。 2　结果 2.1 　HE染色　HCC组织学上多呈梁状，偶为假腺管状，罕见硬化型。CC的腺体结构明显，常为管状结构，偶可见乳头状结构，多数有丰富的纤维性间质。HCC 的间质量明显少于CC者。16周大鼠发癌率73％（11/15），20周大鼠发癌率93％（28/30），其中大多数(70%)为混合型肝癌，，CC约占 20％，HCC约占10％。 2.2　原位杂交检测　CC中多数癌细胞内TGF-β1 mRNA有较强表达，间质中也可见少数阳性细胞; HCC个别区域小部分癌细胞胞浆内TGF-β1 mRNA有弱到中等强度的表达，间质阴性;对照组大鼠肝组织无TGF-β1 mRNA表达； CC的β-actin mRNA表达高于HCC者,其分布类似TGF-β1，但更明显；HCC中β-actin mRNA阳性细胞多于TGF-β1 mRNA者;大鼠胚胎巨核细胞中TGF-β1 mRNA有极强表达，在胎鼠肝细胞中仅弱表达。 3　讨论 　　本实验所用动物模型肝癌发生率与本室以往报道一致，说明诱癌率稳定。 　　TGF-β为一多功能细胞因子，在细胞生长、分化、细胞外基质沉积等过程中起作用〔7〕。本研究观察到大鼠胚胎巨核细胞中TGF-β1 mRNA有极强表达，在胎鼠肝细胞中仅呈弱表达，正常成年鼠肝脏中无TGF-β1 mRNA表达。CC中多数癌细胞TGF-β1 mRNA表达较强，同时，间质中也有少数细胞显示阳性。HCC仅部分区域少数癌细胞胞浆内有弱到中等程度的TGF-β1 mRNA表达,间质TGF-β1 mRNA阴性。Bedossa等〔8〕在人体研究中发现，正常肝脏和肝硬化的肝细胞不表达TGF-β1的mRNA和TGF-β1，肝细胞癌癌细胞胞浆则强烈表达TGF-β1 mRNA和TGF-β1，此差异的原因尚不清楚。 　　尽管TGF-β1在癌细胞中的表达及其意义探讨研究较多，但迄今未见有关TGF-β1表达与癌间质形成关系, 特别是在HCC和CC间质差异形成中可能作用的报道。作者曾观察CC中肌纤维母细胞和ColⅠ、ColⅢ的分布，发现肝癌间质的差异与肌纤维母细胞的量和活性有关，认为肌纤维母细胞是CC中纤维间质的主要来源〔2〕。本文研究显示CC癌细胞TGF-β1 mRNA的表达远高于HCC者，提示TGF-β1可能通过旁分泌激活肌纤维母细胞,后者进而分泌细胞外基质,在HCC和CC间质差异的产生中起一定作用。本研究发现CC中少数间质细胞TGF-β1 mRNA 阳性， Nakatsukasa等〔9〕在化学诱发大鼠肝癌的研究中发现，非实质细胞，尤为desmin阳性的窦周细胞TGF-β1呈明显表达，提示间质细胞自分泌TGF-β1 mRNA的差异在间质差异形成中也有一定作用。 　　原位杂交阳性对照β-actin在上述标本中出现了与TGF-β1 mRNA类似的表达方式，即CC者多于HCC者。β-actin是一种非肌性的胞浆型actin，在细胞骨架和细胞运动中起作用。体外研究发现TGF-β也可促进β-actin mRNA的表达，认为β-actin mRNA的升高可能与TGF-β促进细胞表型的改变有关〔10〕。本实验CC的β-actin mRNA较高表达也可能是TGF-β1作用。 基金项目：日中永和协会基金资助课题 作者简介：朱蕾, 女, 27岁, 硕士, 医师。研究方向: 肿瘤间质及其调控 朱蕾（上海市闸北区市北医院病理科　200435） 路建平（上海医科大学病理学教研室　200032） 朱世能（上海医科大学病理学教研室　200032） 林肇辉（上海医科大学病理学教研室　200032） 野村慎太郎（日本大阪大学医学部病理学教研室） 参考文献 1，Lu JP，Hayashi K. Myofibroblasts and stroma difference between cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma. Arch Histopathol，1996;3:55～62 2，Zhu L, Lu JP, Chen WW et al. An immunohistochemical study on the stroma of experimental liver cancer in rats. 上海：第四届国际病理学会中国区分会及中华医学会病理学会分会联合学术会议,1997: 66 3，Thompson KL, Assoian R, Rosner MR. Transforming growth factor β1 increases transcription of the genes encoding the epidermal growth factor receptor and fibronectin in normal rat kidney fibroblasts. J Biol Chem，1988;263:19519～19524 4，路建平，林肇辉，袁胜涛.混合型肝癌的临床病理特点及诊断.中华肿瘤杂志，1995；17（3）：208～211 5，Yung S, Gunning P, Eddy R et al. Evolution of the functional human β-actin gene and its multi-pseudogene family:conservation of noncoding regions and chromosomal dispersion of pseudogene. Mol Cell Biol，1985; 5(10): 2720～2732 6，袁胜涛，胡锡琪，朱金胜等.低胆碱食物对实验性肝癌发生发展的影响及机制初步探讨.临床与实验病理学杂志，1996；12(1)：57～60 7，Massague J.The transforming growth factor β family. Ann Rev Cell Biol，1990; 6:597～641 8，Bedossa P, Peltier E, Terris B et al. Transforming growth factor β1 and TGF β1 receptors in normal cirrhotic, and neoplastic human livers. Hepatology，1995; 21（3）: 760～765 9，Nakatsukasa H, Evarts RP, Hsia CC et al. Expression of transforming growth factor β1 during chemical hepatocarcinogenisis in the rat. Laboratory in the rat. Lab Invest，1991; 65（5）: 511～517 10，Leof EB, Proper JA, Getz MJ et al. Transforming growth factor β regulation of actin mRNA. J Cell Physiol， 1986;127:83～88