天津医科大学硕士学位
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中文捅斐
目的：研究慢病毒介导RNA干扰小鼠供心al，3GT、NF．rd3
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
达后异种移植物
的存活时间与免疫病理变化。
方法：采用改良Heron技术套袖法建立小鼠到大鼠异种异位心脏移植模型(小
鼠心脏移植到大鼠右侧颈部)。按照RNA干扰供心靶基因不同分组：对照组、
空病毒组、RNAi
al。3GT组、RNAi
NF．r,B组、RNAi
al，3GT+NF．rd3组，每组
8对。观察移植供心存活时间，并使用SABC法检测失功心脏补体C3、[gM、IgG、
NK细胞、巨噬细胞、ICAM．1表达情况。
结果：对照组、空病毒组、RNAial，3GT组、RNAiNF．r,B组、RNAial，3GT+NF-rJ3
组异种移植物的平均存活时间分别为(324-2．5)h，(3
1+2．5)h，(51+4．0)h，(314-1．8)h，
(53+7．3)h．对照组、空病毒组、RNAiNF．r,B组三组移植物生存时间无明显差别
(p>O．05)，RNAial，3GT组、RNAial，3GT+NF．r,B组移植物生存时间较对照组、
空病毒组、RNAiNF．1(B组明显延长(p<0．05)，RNAial，3GT组、RNAial，3GT+
NF．r,B组两组移植物生存时间无明显差别(p>O．05)。
SABC法检测补体C3、IgM、IgG在对照组、空病毒组、RNAi
NF．rd3组三组
均可见大量沉积，且三组间无明显差别(p>o．05)。RNAictl，3GT组、RNAial，3GT
竹晒．心组补体C3、IgM、IgG沉积较对照组、空病毒组、RNAiNF．r,B组减少
O
o．05)；NK细胞、巨噬细胞、ICAM．1在对照组、空病毒组、
RNAiNF．r,B组三组有阳性表达，且三组问无明显差别(p>0．05)，在RNAial，3GT
组、RNAial．3GT+NF．rd3组浸润表达较对照组、空病毒组、RNAiNF．1出组增加
(pO．05)．In
RNAi
al，3GT
and
RNAi
al，3GT+NF-r,B
group，survival
time
of
the
xenogra缸were
prolonged僻0．05)．No
differences
were
found
between
RNAi
al，3GT
group
and
RNAi
al，3GT+NF一心group(p>0．05)．
C3、IgM、IgG
were
obviously
deposited
in
the
xenografls
of
the
control
group，
lentivirus
vector
without
interference
sequence
group，RNAi
NF·r,B
group，
without
differences(p>0．05)．The
deposition
of
C3，IgM，IgC
in
RNAi
al，3GT
group
and
RNAi
al，3GT+NF-，出group
were
less
than
control
group，lentivims
vector
without
interference
sequence
group，RNAi
NF-r,B
group(p0．05)．The
infiltration
ofNK,maerophages
and
ICAM-1
expression
can
be
found
in
the
control
group，lentivirus
vector
without
interference
sequence
group，RNAi
NF—r,B
group，without
difference(p>O．05)．The
infiltration
of
NK,maerophages
and
ICAM-I
in
RNAi
al，3GT
group
and
RNAi
al，3GT+NF—r,B
group
were
more
than
the
control
group，lentivirus
vector
without
interference
Ⅱ
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sequence
group，RNAi
NF—rd3
group(p<0．05)．the
RNAi
al，3GT+NF-r．B
group
was
less
than
the
RNAi
al，3GT
group(p<0．05)．
Conclusion：Xenoantigen
Gala(1．3)Gal
plays
an
important
role
in
mouse
to
rat
cardiac
xenotransplantation．Xenografs
may
survive
longer
by
decreasing
the
expression
of
Gala(1，3)Gal
by
RNAi．Deposition
of
IgM，IgG
and
C3
in
the
xenografts
were
decreased，as
well
as
natural
killer
cells，macrophages，ICAM一1
in
the
xenografls
were
increased，meaning
a
change
from
HAR
to
AVR．The
characteristics
of
the
mouse
to
rat
xenografl
rejection
are
HAR
and
AVR
CO-existenced
and
HAR
plays
more．RNAi
NF—rd3
call
make
the
infiltration
of
Maerophages
and
natural
killer
cells
decreasing,and
the
expresstion
of
ICAM一1
in
the
xenografls
decreasing
too，contributing
to
restraining
AVR．
Key
words：Xenotransplantation；Gala(1，3)Gal；al，3GT；NF-rd3；RNAi；
m
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符号说明
英文缩写
英文全称
中文全称
al，3GT
al，3
galactosyltransferase
al，3半乳糖基转移酶
NF．r,B
nudear
factor-r．B
核转录因子一1①
HAR
hyperacute
rejection
超急性排斥反应
AVR
acute
vascular
rejection
急性血管性排斥反应
ACR
acute
cellular
rejection
急性细胞性排斥反应
RNAi
RNA干扰
dsRNA
double
strain
RNA
双链RNA
Gala(1，3)Gal
Galal．3Gall31-4GlcNAc—R
al，3半乳糖残基
siRNA
小干扰RNA
XNA
异种反应性天然抗体
cDNA
complementary
DNA
互补DNA
RNA
ribonucleic
acid
核糖核酸
sbRNA
small
hairpin
RNA，shRNA
短发夹状RNA
ICAM一1
Inter-CellularAdhesion
Molecule
1细胞间黏附分子一1
PBS
phosphate
buffered
solution
磷酸盐缓冲溶液
mC
immunohistochemistry
免疫组织化学
ROS
reactive
oxygen
species
反应性氧基质
10D
积分光密度值
V
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日IJ吾
研究现状、成果
异种移植面临的第一个障碍是超急性排斥反应(Hyperacute
rejection，HAg)。
它发生于不同种系间的异种移植中，以血栓形成、出血及异种移植物破坏为特
征，通常在移植物血管再通后数分钟至数小时发生。目前对HAR的发生机制已
经有了比较清楚的认识，它的发生是由于人体内预存的异种反应性天然抗体
(Xenoreactive
natural
antibody，XNA)与异种器官血管内皮细胞表面的异种抗原
结合从而引发补体系统的链式激活所致。被天然抗体识别的异种抗原主要是Ql，3
半乳糖残基(Gala(1，3)Gal)，也称Gal表位。它表达于除旧世纪灵长类和人类
外其它所有哺乳动物细胞的表面，本质是一组糖蛋白或糖脂类物质，由Ⅱ1，3半
乳糖基转移酶(a1，39alactosyltransferase，al，3GT)催化形成
。异种移植时，
受者体内预存的异种抗体首先识别并结合异种移植物血管内皮细胞表面的al,3
半乳糖残基(Gala(1，3)Gal)，迅速引发补体的瀑布效应，使之快速沉积到异种移
植物上，形成补体攻击复合物，溶解靶细胞、攻击移植物细胞膜，导致移植物
间质出血、水肿、血栓形成，最终导致移植物在很短时间内失活坏死。Michael[2]
把小鼠心脏移植到大鼠腹股沟区的异种异位心脏移植模型中免疫组化检测到无
干扰因素的失功心脏中大量的强阳性信号的受体IgM，IgG，补体C3沉积，光
镜下发现有广泛的血管内血栓形成。
研究者们对如何成功克服HAR进行了深入的研究，如免疫抑制剂的应用和
清除抗aGal的抗体，但目前认为敲除al，3GT基因是控制HAR最为有效的方
法，近年来，Lai
b3和Phelps
H1等报道他们成功培育出了al，3GT基因敲除猪。
然而，大型哺乳动物的基因敲除技术仍存在许多技术屏障，且费时多，耗费大，
成功率低，目前世界上仅有少数几家科研机构能拥有此项技术，这就使得研究
者们为寻找快速、便捷的方法而努力。
RNA干扰(RNA
interference，删)是真核细胞生物体内抑制特定基因表
达的一种现象，是一种由双链RNA(dsRNA)弓I发的转录后基因沉默机制。在体
内，dsRNA被降解为小分子干扰RNA(siRNA)后导致特异的基因“沉默”。利
用针对a(1，3)GT基因的siRNA，可望实现特异地干扰畎l，3)GT的生成，从
而减少aGal的目的。Zhu等巧1用al，3GT特异siRNA转染猪血管内皮细胞，转
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染后48
hal，3GT表达量减少了约70％，Gala(1，3)Gal相对表达水平降为10．5％～
32．7％，天然抗体厂卒}体结合水平下降程度为IgG44．8％，IgM68．1％，C3c51．4％，
正常人血清对siRNA转染的细胞杀伤较对照组下降59．8％"---69．5％，有效地减
轻了细胞损伤。我实验室应用RNA干扰小鼠血管内皮Gala(1，3)Gal抗原表达，
表达率从95．11+3．56％降为10．24+2．43％，实现了对该抗原的“敲除"效应。
异种移植超急性排斥反应(HAR)被成功控制后，异种急性血管性排斥反
应(AVR)成为移植物失功的主要原因。由于发生机制不明，亦无有效防治措
施而成为目前异种移植所面临的主要免疫学屏障。AVR发生时，血管内皮细胞
持续活化而诱导前凝血酶类、炎性分子表达和微血管血栓形成，并伴天然抗凝物
质表达下降和活性降低，从而导致凝血功能紊乱哺1，供体器官的主要病理变化
为微血管血栓形成，导致器官功能丧失[7,83。大量的实验已经证实，抗aGal抗体
不但会导致HAR，而且在AVR的发生中也起重要作用眇，lo]。Chen等Ⅲ3证实在
不表达aGal的GT．KO猪器官作为供体时，受体中抗tEaGal抗体的诱生是导致
AVR的重要因素。另外，受体的固有免疫细胞如NK细胞【12】和巨噬细胞在AVR中
也起重要作用。chela等【13】发现猪．猕猴心脏移植发生AVR时免疫组织化学可检测
到C3、C4、IgG、IgM沉积，大量的单核细胞、少量的NK．-细胞浸润，ICAM-1
的表达上调。
正常情况下，血管内皮细胞处于静息状态，而在受到各种因素刺激后，其
会发生‘‘激活”，进而引起一系列的生理或病理性反应。可分为I型和Il型激活，
其中II型内皮细胞活化被认为是由NF．r,B介导的转录激活所介导的。
在异种移植中，AVR的发生以“内皮细胞激活”为中心。导致移植物破坏中
的重要一步是由缺血／再灌注损伤介导的。现已发现这是一个多途径的过程。它
的发生依赖于血管内皮细胞活化，粘附分子的表达上调。再灌注后，反应性氧
基质(reactiveoxygen
species，ROS)由缺血组织中释放。然后ROS上调内皮细
胞表面蛋白的表达，包括细胞粘附分子(ICAM．1，VCAM-I，E．选择素和P一选择
素)。内皮表面粘附分子的增加促进了中性粒细胞的粘附和炎症细胞跨膜到损
伤部位。编码粘附分子的基因转录的激活与NF．rd3密切相关【l
4。。
已证实氧化应激能够增加NF．rd3的活性【15】。再灌注以及接下来的移植物的
再氧合就导致了反应性氧物质和内皮组织来源的耵盯一a的增加，TNF．a通过细
胞外信号传导系统，首先激活细胞内的NF．rd3，继而NF．rd3下游调节产物
ICAM．1、VCAM-1和MCP．1在TNF．q刺激下表达升高￡J6’171。
2
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NF．1c
B作为在同种异体移植排斥反应中的关键因子提示NF．r,B靶向治疗在
移植中可能有效。Squadrito等在小鼠模型用腺相关病毒载体介导的I-r,Ba基因
转染后发现可阻断NF．1出核转位㈣；Burke等指出基于当前对IKK／NF．r,B作用
的理解，靶向Ir,．B的激酶(Ir．B
kinase，IKK)也是一个新手段【l
91，同种异体移植
排斥反应可被显著的降低。
利用近年来被广泛应用的RNA干扰技术构建针对NF．rd3
p65的小干扰RNA
(short
interfering
RNA，SiRNA)，可使NF．1cB的基因在转录后“沉默”，降低其
表达，从而使与细胞粘附有关的VCAM、ICAM．1等因子表达减低，在理论上可
以控制异种移植物血管内皮细胞的激活，并且对T细胞介导的异种细胞免疫排
斥反应将有一定的作用。
已有研究证实利用RNA干扰技术可下调猪血管内皮细胞表面的Gala(1，3)Gal
的表达【20】。在同种移植中抑制NF．r,B的表达可延长移植物的存活时剐211，但在
异种移植中少见相关文献报道。我实验室已成功实现了靶向al，3GT、NF—r,B的
RNA干扰，沉默al，3GT基因从而下调Galct(1，3)Gal蛋白的表达，抑制了血管内
皮细脚．1出的活性。这为克服异种移植中的HAR和AVR提供了一条新途径。
小鼠到大鼠的心脏移植模型属于协调性异种移植，据文献报导平均存活2天
左右，异种抗原(Gala(1，3)Gal)在排斥反应中是否起作用，以及小鼠到大鼠的
心脏移植排斥反应中是否存在HAR是目前争论的焦点。
研究目的、方法
本实验拟通过改良Heron套袖法建立小鼠到大鼠异种异位心脏移植模型，利
用RNA干扰方法抑制供,L,al，3GT、NF．r,B表达，观察各组供心存活时间变化，并
应用SABC法检测C3、IgM、IgG、NK细胞、巨噬细胞、ICAM·l在失功心脏中沉
积变化情况，研究RNA干扰方法抑制供，L,al，3GT、NF—r,B表达对异种移植物免
疫病理的影响。
3
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对象和方法
本实验拟通过改良Heron套袖法建立小鼠到大鼠异种异位心脏移植模型，利
用RNA干扰方法抑制供一t∑,al，3GT、NF．rd3表达，观察各组供心存活时间变化，并
应用SABC法检fllJC3、IgM、IgG、NK细胞、巨噬细胞、ICAM．1在失功心脏中沉
积变化情况，研究RNA干扰方法抑制供一I),al，3GT、NF．rd3表达对异种移植物免
疫病理的影响。
RNA干扰Balb／c小鼠心脏al，3GT、NF．1(B表达，并移植到相应F344大鼠
右侧颈部。按照RNA干扰供心靶基因不同分组：对照组、空病毒组、
RNAi
al，3GT组、RNAi
NF．r,B组、RNAi
al，3GT+NF．1cB组，每组8对。观察移植供
心存活时间变化，失功心脏取10％中性甲醛浸泡固定。取10％中性甲醛浸泡固
定过的失功心脏标本制作蜡块，作5um厚组织切片。常规HE染色，光镜观察
组织病理改变。采用SABC法检测失功移植物补体C3、IgM、IgG、NK细胞、
巨噬细胞、ICAM．1的沉积情况。
1．实验动物
实验所用小鼠为健康成年雄性Balb／c小鼠，体质量20"--259，大鼠为健康成
年雄性F344大鼠，体质量200-2509。所有动物均由天津市药物研究所实验动物
中心提供，在温暖通风环境下普通饲料喂养。
2．主要试剂、药品
(1)供心灌注液(4℃)：
肝素钠(Heparin
Nalrium)25u／ml
(2)器官保存液(4℃)：
乳酸钠林格氏液(Lactated
Ringer's
Solution)
(3)麻醉药品：
4％水合氯醛(ChloralH
ydrate)
(4)阿托品、头抱哇琳、生理盐水等
(5)针对小鼠血管内皮的al，3GT、NF．1cB慢病毒干扰质粒由本实验室构建
(6)C3：兔抗大鼠补体C3亲和纯化抗体(BA-2298，博士德，武汉)
(7)IgM：
羊抗大鼠IgM亲和纯化抗体(GTX77095，Gene
Tex，美国)
(8)IgG-
兔抗大鼠IgG亲和纯化抗体(BAl042，博士德，武汉)
(9)CD54：兔抗大鼠ICAM．1多克隆抗体(BA2189，博士德，武汉)
(10)CD57：羊抗大鼠NK细胞亲和纯化抗体(Se-49195，SANTA，美国)
(11)CD68：兔抗大鼠巨噬细胞多克隆抗体(bs．0649R，博奥森，北京)
(12)兔抗大鼠即用型SABC免疫组化试剂盒：5％BSA封闭液、生物素化羊
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抗兔IgG、链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)
(SA．1021，博士德，武汉)
(13)羊抗大鼠即用型SABC免疫组化试剂盒：5％BSA封闭液、生物素化兔
抗羊IgG、链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)
(SA．1021，博士德，武汉)
(14)多聚赖氨酸(博士德，武汉)
(15)(14)3％H202(东方化工厂，天津)
(16)甲醇2(东方化工厂，天津)
(17)多聚赖氨酸(博士德，武汉)
(18)枸橼酸盐缓冲溶液(中杉金桥生物技术有限公司，北京)
(19)PBS溶液(0．01M
pH
7．2—7．4)-Nacl
8．59,NaH2P04
0．49,Na2HP04·12H20
2．89／2000ml蒸馏水，以1N
NaOH调整pH至7．2，过滤(自配)
(20)DAB显色试剂盒(博士德，武汉)
(21)中性树胶(上海标本模型厂，上海)
(22)苏木素(博士德，武汉)
(23)0．5—1％水溶性伊红染液(配N-伊红Y0．5—1克，蒸馏水75毫升，95
％酒精25毫升先取少许蒸馏水加入伊红，用玻璃棒研碎，再加入全部
蒸馏水，溶解后加入酒精)
(24)多聚甲醛(天津文达稀贵试剂化工厂)
3．主要实验仪器、器材
(1)OPTON双人双目手术显微镜(德国蔡司)
(2)纤维手术器械
(3)普通手术器械
(4)微型手术电凝器(ALCON美国)
(5)纤维外科手术缝合线及结扎线
(6)灌注插管及动、静脉血管套管用各种121径PVC塑料管、lml注射器等．
(7)全自动切片机(LeicaRM2255，德国)
(8)石蜡包埋机(LeicaEGl
150H，德国)
(9)冰台(LeieaEGl
150L，德国)
(10)电热恒温培养箱(天津市实验仪器厂，天津)
(11)(12)高压蒸锅
(北京沃德生物医学仪器公司，北京)
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(12)电子分析天平(上海衡平仪器仪表厂，上海)
(13)生化摇摆平台
(北京沃德生物医学仪器公司，北京)
(14)图像采集系统(OLYMPUS，日本)
(15)倒置显微镜X
51(OLYMPUS，日本)
4．套袖法建立小鼠到大鼠异种异位心脏移植模型的方法
小鼠对大鼠异种移植属协调性异种移植，供心血运恢复后颜色鲜红、搏动有
力且12小时后仍搏动良好者认为手术成功。
4．1术前准备
(1)供、受体术前均不需禁食、禁水。
(2)受体动物术前30分钟皮下注射阿托品O．05mg／kg。
(3)受体动物术前30分钟预防性肌肉注射头孢唑啉40
mg／kg。
(4)制作血管套管。分别以上述PVC塑料管制作动、静脉套管，连接颈外静
脉的套管外径为1．2mm，内径为1．1mm，连接颈总动脉的套管外径为
1．Omm，内径为0．9ram。套管全长约4mm，其中套管套入部长2mm，
管柄长2mm。
4．2受体手术
(1)按7．5
mg／kg予以4％水合氯醛腹腔内注射麻醉。
(2)颈部手术区备皮后，受体大鼠取仰卧位，四肢及头部固定，70％酒精消
毒手术区域，准备行清洁手术。
(3)于右颈前外侧纵行切开皮肤，上至下颌基底部，下至锁骨。分离皮下脂
肪组织，解剖出颈外静脉，并尽可能长的游离该血管。近心端以微血管
夹夹闭后，近颅侧结扎，离断静脉远心端。以肝素盐水(50u／m1)冲去
血管近心端游离段的血液及血凝块。
(4)于颈外静脉内侧离断部分颈前肌群，寻找颈总动脉，小心分离颈总动脉
与颈总动脉鞘内其它组织，避免损伤血管、神经。尽可能长的游离该动
脉后，近心端以微血管夹夹闭，远心端结扎，近结扎线处剪断颈总动脉。
同样以肝素盐水(50u／m1)冲去血管近心端游离段的血液及血凝块。
(5)将静脉套入其套管中，无损伤血管钳夹住套管管柄及血管固定，以纤维
镊帮助使静脉壁外翻套于套管上，6-0丝线结扎固定。同法套入动脉套
管。再次以肝素盐水冲洗血管游离段，防止血凝块形成。
(6)受体大鼠颈部切口外敷湿盐水纱布，等待植入供心。
6
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4．3供体手术
(1)供体小鼠同样采用4％水合氯醛按7．5
mg／kg腹腔内注射麻醉。
(2)取仰卧位，四肢固定，70％酒精消毒手术区域。
(3)沿腹正中切口进入腹腔，自下腔静脉注入肝素盐水(50u／m1)O．5ml，使全身
血液肝素化。
(4)剪开膈肌，沿两侧腋前线剪断肋骨，向上翻起前胸廓暴露心脏，并打开
心包。
(5)自肝上下腔静脉插管缓慢注入4"C含有25u／ml肝素的乳酸钠林格氏液，
同时剪开降主动脉，可见心脏明显变白，并逐渐停跳。总灌注量约为3ml。
(6)供心表面外敷4℃冷盐水纱布。小心分离升主动脉和肺动脉，紧靠无名
动脉起始和肺动脉分叉处分别剪断主动脉和肺动脉。以5-0丝线将其余
进出心脏的所有血管集束结扎。迅速剪下心脏，置入4"C乳酸钠林格氏
液中备用。
4．4供心植入
(1)供心放入受体大鼠颈部切口中，以4"C冷盐水纱布包裹。
(2)于供心肺动脉边缘缝一针牵引线，将受体大鼠颈外静脉套管端插入供心
肺动脉内，以6-0丝线环扎固定。同法将颈总动脉套管插入供心主动脉
内，环扎固定。
(3)先松开静脉血管夹，然后再松开动脉血管夹，可见心脏立即充血、变红，
开始出现心肌纤颤，并迅速转变为自主节律性跳动，心率约为160．200
次／分。
(4)术毕缝合皮肤。注意摆好供心位置，防止动静脉打折。
4．5术后处理及观察
(1)术中如果出血较多，可经大鼠阴茎背静脉给予706代血浆Iml；出血不
多勿需特殊处理。
(2)术后注意保暖，可用灯光照射加温1h，并保持室温约28"(2。
(3)术后可自由进食、饮水，术后三天内给予5％葡萄糖氯化钠溶液口服。
(4)小鼠供心植入后，于受体大鼠颈部可直接观察到供心搏动情况。术后观
察供心跳动情况，从供心复跳至完全停止跳动的时间作为供心存活时
间。
5．小鼠到大鼠异种异位移植动物模型分组
7
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每组8对：
(1)对照组：供体小鼠在取心脏前六天，阴茎背静脉注入0．3m10．9％生理盐水，
移植后当供心失功时取下，10％中性甲醛固定。
(2)空病毒组：供体小鼠在取心脏前六天，阴茎背静脉注入lxl07不携带
al，3GT．shRNA的重组慢病毒稀释液(O．9％生理盐水含慢病毒共0．3m1)，
移植后当供心失功时取下，10％中性甲醛固定。
(3)RNAial，3GT组：供体小鼠在取心脏前六天，阴茎背静脉注入1x10
7携
带al，3GT．shRNA的重组慢病毒稀释液(0．9％生理盐水含慢病毒共
0．3m1)，移植后当供心失功时取下，10％中性甲醛固定。
(4)RNAiNF．r,B组：供体小鼠在取心脏前六天，阴茎背静脉注入l
x
10。7携带
NF．rd3．shRNA的重组慢病毒稀释液(0．9％生理盐水含慢病毒共0．3m1)，
移植后当供心失功时取下，10％中性甲醛固定。
(5)RNAiotl，3GT，NF．r,B组：供体小鼠在取心脏前六天，阴茎背静脉注入
lxl07携带al，3GT．shRNA的重组慢病毒稀释液和1x10
7携带NF．r,B
．shRNA的重组慢病毒稀释液(0．9％生理盐水含慢病毒共0．3m1)，移
植后当供心失功时取下，10％中性甲醛固定。
6．制作蜡块、切片
(1)切取失功心脏右心室组织厚约2mm组织块，浸入70％乙醇过夜
(2)80％乙醇浸泡
60分钟
(3)90％乙醇浸泡
70分钟
(4)95％乙醇浸泡I
30分钟
(5)95％乙醇浸泡
II
30分钟
(6)100％乙醇I浸泡
35分钟
(7)100％乙醇II浸泡
35分钟
(8)二甲苯
I浸泡
15分钟
(9)二甲苯
Il浸泡
25分钟
(10)浸蜡左
浸泡
20分钟
(11)浸蜡右
浸泡
70"-'80分钟
(12)滴蜡制作注意：
注蜡后再将组织进入蜡中
(13)冰台制冷，可置412冰箱，利于蜡块脱出
(14)切片，51ma连续切片，水浴箱展开切片，置于65℃恒温箱烤片3小时，
8
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使切片紧密粘附，以减少脱片，(载玻片已提前用多聚赖氨酸处理：将
载玻片浸泡于1％盐酸酒精中过夜后洗净、干燥后放入1：10比例的去离
子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温浸泡5．10分钟，60"C烤箱烘烤30．60
分钟或室温过夜干燥。装盒备用。)
7．苏木素．伊红(HE)染色方法
苏木素．伊红染色，在组织病理学中，是一种日常使用最为广泛的常规染色
方法。一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为
病理诊断的确切依据。再根据此染色切片所见，分别进行不同的特殊染色。
7．1脱蜡
(1)将切片浸入二甲苯l中脱蜡5一lO分钟
(2)将切片从二甲苯1移入二甲苯2约2—5分钟
(3)将脱蜡切片移入无水酒精1约1—5分钟
(4)将切片从无水酒精l移入无水酒精2中l一2分钟
(5)将切片浸入95％酒精1～3分钟
(6)移入80％酒精内浸洗1—3分钟
(7)自来水洗去切片上的酒精
(8)再以蒸馏水清洗切片以防污染苏木精
7．2苏木素一伊红染色(HE)
(1)苏木精染液染色5—15分钟
(2)自来水洗3—5分钟
(3)0．5一l％盐酸酒精溶液分化数秒钟
(4)自来水洗l一5分钟
(5)弱碱水溶液显蓝30—60秒钟
(6)自来水充分冲洗5一lO分钟或更长时间
(7)镜检着色程度，如不适宜可作相应处理
(8)蒸馏水洗l一2次
(9)伊红染液染色时间3．5分钟
(10)蒸馏水洗l一2次
7．3封固
(1)80％酒精30--40秒
(2)95％酒精30一60秒
9
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(3)无水酒精1约1—5分钟
(4)无水酒精2约1—5分钟
(5)二甲苯1约l一5分钟
(6)二甲苯2约1—5分钟
(7)用玻璃棒占蘸取少许中型树胶，滴于组织处，然后取盖玻片从一侧小心
放下，注意不要有气泡，室温保存，光镜下观察。
8．免疫组化染色方法
8．1基本原理(图1)
免疫组织化学(Immunohistochcmistry，IHC)是利用抗原与抗体特异性结
合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)
显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)，简称免疫组化。由于抗原抗体间的结
合是高度特异的，组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质(如蛋白质、氨
基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等)，都可以用相应的特异
性抗体进行检测。具有特异性强、灵敏度高、反应迅速且定位准确的特点。亲
和免疫组织化学技术是采用某些对某中组织成分具有高度亲和力的物质如植物
凝集素、生物素、葡萄球菌A蛋白来连接抗原、抗体和示踪物质等，更有利于
微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位检测。
本实验采取免疫组织化学中较为先进、敏感性高的亲和组织化学技术：链
酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(StrcptAvidin．Biotin-Complex，SABC)，
SABC是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分
布。链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量为65kD，同亲和素一
样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。亲和
素是一个碱性蛋白(IP=IO)，经改造后可以变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点
点接近中性，坤=6．0．6．5，对组织和细胞的非特异吸附很低，因此采用链霉亲和
素的免疫组织化学方法背景染色很低。根据研究，SABC大约可形成一百个左右
的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物，大量的酶将保证
SABC具有很高的敏感性。SABC法兼具低背景和操作简便的优点。
在SABC法染色过程中，以二抗来源的动物血清作封闭液，减少非特异性
着色，兔(或山羊)抗大鼠的单(或多)克隆抗体作为一抗与切片组织中的抗
原反应，4度冰箱中过夜，继而使用生物素化的第二抗体与结合在切片组织抗原
10
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上的第一抗体反应，然后用SABC与结合在第一抗体上的第二抗体进行反应，
最终通过过氧化物酶复合物与底物DAB作用形成不溶性的棕褐色颗粒而完成染
色过程，以检出待测抗原表达及分布情况。
+
图l免疫组织化学SABC法原理示意图
8．2、免疫组化实验步骤
(1)石蜡切片脱蜡
1)60℃烤片l小时
2)二甲苯I
浸泡
30分钟
3)二甲苯H
浸泡
30分钟
4)100％乙醇I浸泡
10分钟
5)100％乙醇Ⅱ浸泡
lO分钟
6)95％乙醇
浸泡
10分钟
7)80％乙醇
浸泡
10分钟
8)70％乙醇
浸泡
10分钟
9)蒸馏水冲洗
2分钟×3次
(2)用新鲜配制的3％甲醇过氧化氢200ml(甲醇180ml，30％过氧化氢20m1)
孵育lO分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗5分钟×3次。
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(3)高压加热抗原修复：将切片放入盛有抗原修复液(枸橼酸盐缓冲液
0．01M，PH6．O)的烧杯置高压锅内，加热至喷气并持续2分钟后自然冷
却至室温(切片仍浸于修复液之中)，以便使蛋白质能够恢复原有的空间构
型。PBS冲洗3次共lO分钟。
(4)擦去标本周围多余的液体。滴加5％BSA封闭液，室温孵育30分钟，倾
去血清，不洗涤。
(5)滴加一抗工作液(抗体的稀释度均为l：100)，于湿盒中4℃过夜(约1
8
小时)
(6)室温复温20—30分钟
(7)PBS振洗5分钟，共3次。擦去多余的液体，滴加生物素化二抗，37℃湿
盒中孵育30分钟
(8)PBS振洗5分钟，共3次。擦去多余的液体，滴加SABC，37℃湿盒中孵
育20分钟
(9)PBS振洗5分钟，共4次。DAB显色，使用DAB显色试剂盒，A、B、C
液各一滴加入1000ul蒸馏水中(避光)，充分混匀后加至玻片，室温显色
5—10分钟后自来水冲洗，并不定时在镜下观察，至出现棕黄色颗粒为止，
以蒸馏水充分冲洗终止显色
(10)苏木素复染细胞核
1)苏木素复染细胞核2min，自来水冲洗5min
2)1％盐酸酒精10秒钟，自来水冲洗5min
3)淡氨水显蓝20秒，自来水冲洗5min。
(11)脱水透明
1)80％
乙醇
浸泡
5min
2)95％
乙醇I
浸泡5min
3．)95％
乙醇II
浸泡5min
4)100％
乙醇I
浸泡5min
5)100％
乙醇II
浸泡5min
6)二甲苯I
浸泡10min
7)二甲苯II
浸泡10rnin
(12)封片适当滴加二甲苯稀释中性树胶，覆盖盖玻片。
(13)显微镜下观察
12
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9．统计学方法
结果用均数4-标准差(珏s)表示，多组比较采用单因素方差分析，均数间两
两比较采用LSD(Least
Significant
Deviation)法，两变量间关联性分析时，采
用Pearson相关分析，所有统计结果以p<0．05为差异有统计学意义标准。均采用
SPSS
13．0统计软件包进行分析处理。
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9士甲
二日7R
1．／J、鼠到大鼠异种异位心脏移植模型各组移植供心存活时间。
1．1移植心脏存活时间
小鼠供心植入后，于受体大鼠右侧颈部可直接观察到供心搏动情况。术后观
察供心跳动情况，从供心复跳至完全停止跳动的时间作为供心存活时间。对照组、
空病毒组、RNAial，3GT组、RNAiNF．rd3组、RNAial，3GT+NF．r,B组异种移植
物的平均存活时间分别为(32+2．5)h，(314-2．5)h，(51+4．0)h，(31+1．8)h，(534-7．3)h．
存在显著性差异(pO．05)，
RNAial，3GT组、RNAial，3GT+NF．r,B组移植物生存时间较对照组、空病毒组、
RNAiNF．rd3组明显延长@<0．05)，RNAial，3GT组、RNAial，3GT+NF-r,B组两组
移植物生存时间无明显差别(p>0．05)，见表2。
表2各组生存时间两两比较
注：*／7<0．05
2．苏木素．伊红染色(髓染色)
2．1各组HE染色病理改变(经倒置显微镜x
51、图像采集系统采集)
正常心肌HE染色显示：血管内皮细胞无水肿，间质血管无血栓形成，无间
14
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质无出血、心肌间质无单核细胞浸润(见图1)；对照组、空病毒组、RNAiNF—rd3
组被排斥心脏间质出血、水肿、多数血管内有血栓形成，尤其以大血管明显，部
分心肌坏死崩解(见图2)；RNAial，3GT组被排斥心脏有血栓形成，以微血栓为
多，还可见间质出血及大量单核细胞浸润(见图3)；RNAial，3GT+NF．r．B组被
排斥心肌HE染色可见微血栓形成及单核细胞浸润减少(见图4)。
图2对照组心肌HE染色(X400)
图3RNAi
al，3GT心肌HE染色
图4RNAial，3GT+NF-kB心肌HE
(×400)
染色(X400)
3．免疫组化染色结果
3．1染色结果判断方法
免疫组织化学染色质控分析见表3。以PBS代替一抗作阴性对照。补体C3、
I酬、196阳性均成棕黄染色或棕褐色，主要沉积于血管壁和问质；CD54主要表
达于内皮细胞表面和部分心肌细胞，细胞膜呈棕黄色或棕褐色染色为阳性；CD57、
CD68阳性细胞的细胞质／膜呈棕黄染色或棕褐色。
15
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使用显微镜图像采集系统采集补体C3、IgM、IgG、NK细胞、巨噬细胞浸
润，ICAM．1免疫组化染色切片图像，在相同条件下随机拍摄5个200／400倍视
野，使用图像分析软件Image
Pro
Plus5．1对免疫组化进行分析，以积分光密度值
(Integrated
Optical
Density,IOD)作为分析指标，取其平均值。将所得数据输入
spssl3．0进行统计分析。
表3免疫组织化学染色实验组与对照组结果分析
例号
阳性对照
阴性对照
实验组
结论
1
操作错误
2
+
+
+
非特异性反应
3
+
+
+
阴性对照含定位Ag
——
4
+
受检组织不含定位Ag
5
+
+
受检组织含定位Ag
3．2各抗体在各组的沉积情况比较。
3．2．1补体C3、IgM、IgG在各组的沉积有明显差异∽0．05)见表4。
表4各组补体C3、IgM、IgG在各组异种移植物的沉积表达情况比较。
注：々Ko．05．
3．2．1．1补体C3在各组的沉积比较。
对照组、空病毒组、RNAiNF-rd3组三组补体C3沉积无明显差别(p>O．05)，
RNAi
al，3GT组、RNAial，3GT+NF-r．B组C3沉积较对照组、空病毒组、RNAi
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NF．r,B组减少Q<0．05)，RNAial，3GT组、RNAictl，3GT+NF—rd3组两组无明显差别
(p>O．05)，见表5。(图5、6)
表5补体C3各组沉积两两比较
注：协O．05
毋p碗毵#“
t落
。
磷
t
魂
瓣魂
o
i，
i毫
j
?；
攀。，l∥鬟I?泰麓i瑟．j|
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0
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’
i?i感基纛篡凄鬻||
警
≥_囊。i，嚣毫：≥。。薯鞭。l=搿。i盗玉_
图5对照组移植心补体C3沉积
图6
RNAi
al，3GT组补体C3沉积
(SABC×200)
SABCX200)
3．2．1．2
IgM在各组的沉积情况比较。
对照组、空病毒组、RNAiNF．r,B组三组IgM沉积无明显差别(p加．05)，RNAi
al，3GT组、RNAial，3GT+NF．r,B组IgM沉积较对照组、空病毒组、RNAi
N蕃一1cB
组减少@<0．05)，RNAial，3GT组、RNAial，3GT+NF一1园组两组无明显差别
(p>o．05)，见表6。(图7、8)
表6
IgM各组沉积两两比较
注：’O．05)，RNAi
al，3GT组、RNAial，3GT+NF-r,B组IgG沉积较对照组、空病毒组、RNAiNF—r．B
组减少∽0．05)，RNAi伍1，3GT组、RNAial，3GT+NF-r,．B组两组无明显差别
(p>O．05)，见表7。(图9、10)
表7
Igt3各组沉积两两比较
注：’(o．05
图9对照组IgG沉积(SABCX200)
．图10
RNAi
al，3GT组IgG沉f6；[(SABCx200)
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3．2．2
NK细胞、巨噬细胞、ICAM．1在各组的浸润表达有明显差异(po．05)，
RN加a1，3GT组、RN加Q1，3C限卜NF一1cB组NK细胞浸润较对照组、空病毒组、
RNAiNF．1m组增多0<0．05)，RNAial，3G]阡NF-r,B组较RN加al，3CIT组减少
(p0．05)，
RNAi
al，3GT组、RNAial，3GT+NF—r,B组巨噬细胞沉积较对照组、空病毒组、
RNAi
NF—r,B组增大0<0．05)，RNAial，3GT+NF．r,B组较RNAial，3GT组减少
(pO．05)，
RNAi
al，3GT组、RNAial，3GT+NF．f13组ICAM-I表达较对照组、空病毒组、
RNAiNF．r：B组增；011(p<0．05)，RNAial，3GT+NF—r．B组较RNAial，3GT组减少
(p<0．05)，见表11。(图15、16)
表11
ICAM一1各组表达两两比较
注：*-p
要求
对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗
，对动物损伤小，并发症少。(2)传统的袖套法中需
要特殊的套管和内支持管，以便于外翻血管晦1，而本法只需选择适合血管外径的
套管即可，将套管制成带一短壁的套管，术中用无创显微血管钳钳夹固定臂环境
手术操作台，行动、静脉外翻时用显微镊直接外翻固定即可，而不需使用内支撑
管，从而减少了寻找特殊套管的难度，也减少了损伤血管内膜的机会，降低了手
术操作的复杂性：行血管连接时操作也较容易，缩短了手术时间和增加了手术的
成功率。(2)用本法在摘取供体心脏前已将受体颈总动脉和颈外静脉外翻固定
于套管上，当摘取供体心脏后很短时间内就能连接于受体之颈总动脉和颈外静
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脉上，这样缩短了供心的冷缺血时间。因为据文献报道移植供心即使在4℃保
存液中也仅可保存4一--6h，冷缺血时间过长也可对供心造成不可逆的损伤口71。
有利于保护心肌，缩短手术时间，增加手术成功率。(3)从肝上下腔静脉插管
进行供心灌注，此灌注方法比经主动脉灌注简便，且效果好。
本实验采用的改良Heron套袖法建立小鼠到大鼠的异种异位移植模型实验
动物个体小易操作，容易饲养，价格便宜，采用改良Heron套袖法对受体损伤小，
并发症发生率低，手术成功率高，是研究异种移植免疫排斥反应的良好模型。
本试验中平均手术时间为(66．25±5．8)分钟、取供心时间为(2．4±0．5)分钟、
供心温缺血时间为(6．13±1．69)分钟，手术成功率92．5％。
2．RNA干扰al，3GT与异种lIAR
随着器官移植技术在临床上的应用越来越广泛，供体不足的矛盾就越来越
突出，这就要求研究者们必须对异种移植进行更深入的研究。然而，异种移植
后将出现比同种异体移植更为复杂的排斥反应。其中包括：超急性排斥反应
(hyperacute
rejection。HAR)、急性血管性排斥反应(acute
vascular
rejection，
AVR)、急性细胞性排斥反应(acute
cellular
rejection，ACR)和慢性排斥反应
(chronic
rejection，CR)等。要想使异种移植成功应用于临床，就必须克服这
些复杂的排斥反应。
HAR是异种移植面临的第一个障碍，它发生于两种不同种属的个体之间进
行异种移植时，目前对HAR的发生机制已经有了比较清楚的认识，它的发生是
由于人体内预存的异种反应性天然抗体(Xenoreactive
natural
antibody，XNA)与
异种器官血管内皮细胞表面的异种抗原结合从而引发补体系统的链式激活所
致。补体是机体免疫防御系统的重要组成成分，它是存在于人和脊椎动物血清
与组织液中的一组具有酶活性、不耐热的蛋白质。19世纪末，在发现体液免疫
后不久，Border即证明，新鲜血清中存在一种不耐热的成分，可辅助特异性抗体
介导的溶菌作用，故称其为补体。补体系统由30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白
组成，约占血清总蛋白的5*／,-6％，多数补体分子属于p球蛋白，少数属a(如Cls，
D因子)及7球蛋白(如Clq，c8)。某些补体的固有成分对热不稳定，经56℃30rain
即可灭活，室温下也会很快失活，在0-10℃中活性仅能保持3—4天，紫外线照射、
机械振荡等均可使其破坏。补体广泛参与机体抗微生物防御反应以及免疫调节，
也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应系统和效
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应放大系统【28】在生理情况下，血清中大多数补体成分均以无活性的酶前体形
式存在，只有在某些活化物的作用下或在特定的表面上，补体各成分才依次活
化，发挥其生物学效应。补体的激活过程根据其起始顺序的不同，可分为经典
途径(ClassicalPathway，CP)和旁路途径(Altemal
Pathway,AP)。经典途径又称
为第一途径，它是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式。抗体与相应抗原
结合形成的免疫复合物(Immune
Complex，IC)是经典途径的主要激活物。IC中抗
体的Fc段构象发生改变，与Cl结合，成为补体经典途径激活的始动环节。然后，
活化的Cls依次酶解C4，C2，形成具有酶活性的C3转化酶，后者进一步酶解
C3并形成C5转化酶。旁路途径又称为第二途径，不经过C1，C4，C2，而由C3，B
因子、D因子参与激活过程，C3成为启动旁路途径的关键分子。旁路途径形成
的C5转化酶同经典途径一样，可裂解C5，引起共同末端效应。经典激活途径，
旁路激活途径其共同通路是形成C3转化酶，裂解C3，C5，最终造成细胞溶解。
故本实验中采用免疫组化检测兔抗大鼠补体C3亲和纯化抗体的沉积程度可提示
大鼠体内补体的激活程度。
被天然抗体识别的异种抗原主要是Q
1，3半乳糖残基(Gal
Q(1，3)Gal)，也
称Gal表位。它表达于除旧世纪灵长类和人类外其它所有哺乳动物细胞的表面，
本质是一组糖蛋白或糖脂类物质，由Q
1，3半乳糖基转移酶(a
1，39alactosyltransferase，Q
1，3GT)催化形成
。异种移植时，受者体内
预存的异种抗体首先识别并结合异种移植物血管内皮细胞表面的Q
1，3半乳糖
残基(Gal
Q(1，3)Gal)，迅速引发补体的瀑布效应，使之快速沉积到异种移植
物上，形成补体攻击复合物，溶解靶细胞、攻击移植物细胞膜，导致移植物间
质出血、水肿、血栓形成，最终导致移植物在很短时间内失活坏死。异种移植
超急性排斥反应的典型病理特征为细胞间质出血、水肿，多数伴中性粒细胞浸润
及血栓形成啪】。陈栋侧作的猪到猕猴的异种心脏移植中失功心脏表现为心肌间
质弥漫性出血、水肿，毛细血管内普遍淤血，无明显炎症细胞浸润：心肌细胞可以
有局灶性坏死，或仅见轻度变性，而无明显坏死：免疫组化检测发现移植心脏有
补体C3、C4及C5b-9的沉积，IgG及IgM的沉积，两者沉积强度差异不大。Michaelt2l
把小鼠心脏移植到大鼠腹股沟区的异种异位心脏移植模型中免疫组化检测到无
干扰因素的失功心脏中大量的强阳性信号的IgM，IgG，补体C3沉积，光镜下发
现有广泛的血管内血栓形成。本实验小鼠到大鼠的异种异位心脏移植模型中对
照组、空病毒组、l州础NF。x
B组失功心脏HE染色发现间质出血，水肿，多数
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血管内有血栓形成，尤其以大血管明显，部分心肌坏死崩解。免疫组化检测发
现对照组、空病毒组、RNAi
NF．K
B组失功心脏有大量的补体C3、IgM、IgG沉
积。
超急性排斥反应是异种移植走向成功的第一个障碍，研究者们对如何成功
克服它进行了广泛的研究，到目前已发展出若干种方法。(1)清除抗d
Gal的抗体
Watts等
利用血浆分离置换仪与Gal亲和层析柱用体外免疫吸附(extracorporeal
immunoadsorption，EIA)的方法几乎全部去除了抗Q
Gal的抗体(2)酶学竞争这是
利用Q
f1，3)GT与其他一些糖基转移酶具有相同的糖基接受底物N一乙酰基乳
糖胺从而相互竞争这一底物的原理而设计的。(3)酶处理去除Q
Gal抗原：产气荚
膜梭菌的B半乳糖苷酶C可以破坏该抗原结构中B半乳糖的连接。“u等f32】用该
酶溶液给猪静脉注射，4～8小时后猪肾血管内皮细胞上的Q
Gal抗原可完全清除，
12d,时后不仅没有发现组织损伤，同时98％的红细胞上的q
Gal抗原也可被分解，
但是24小时后又会出现。如间隔一段时间后(约2个月)再次注射，清除效果依
然显著，没有蓄积毒性。但就目前研究现状而言，酶处理去除Q
Gal抗原只是暂
时性的，而不能阻止该抗原的再次出现。(4)可以通过反义cDNA，反义寡核苷酸
或反义核酶等几种方式来破坏12．(1，3)GT的mRNA从而抑制Q
Gal的表达。如
Hayashi等D33在体外实验中，用外源性的反义寡核苷酸使猪内皮细胞上Q
Gal的
表达下降T40％。(5)补体是HAR发生的核心，利用转基因技术可使供体表达
受体的补体调节蛋白以抑制受体补体激活。研究较多的是人衰变加速因子DAF
(CD55)和同源限制因子(CD59)。Byrne
B钔等运用CD55／CD59转基因鼠的
心脏进行人血浆体外灌注实验，发现基本抑St]HAR，心脏成活时间明显延长。(6)
敲除Q(1，3)GT基因：通过对供体某些基因进行遗传修饰，使异种抗原低表达
或不表达，这是防止HAR最根本措施之一，然而，大型哺乳动物的基因敲除技术
仍存在许多技术屏障，且费时多，耗费大，成功率低，目前世界上仅有少数几
家科研机构能拥有此项技术，这就使得研究者们为寻找快速、便捷的方法而努
力。(7)RNA干扰Q(1，3)GT基因RNA干扰(RNA
interference，RNAi)是真
核细胞生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是一种由双链RNA(dsRNA)弓I发
的转录后基因沉默机制。在体内，dsRNA被降解为小分子干扰RNA(sil斟A)后
导致特异的基因“沉默"。利用针对Ⅱ(1，3)GT基因的siRNA，可望实现特异地
干扰Q(1，3)GT的生成，从而减少q
Gal的目的。
RNA干扰(RNA
Interference,RNAi)是真核生物中一种普遍存在且非常保
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守的机制，与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关，它由双链RNA介导，
在转录后水平通过与mRNA特异性互补结合导致mRNA降解，从而导致序列特
异性的转录后基因沉默，且这种效应具有两个明显的特征，特异性和高效性。
RNA干扰于1998年最先由Fire等人描述，RNAi技术一经发现，就立即成为2l
世纪初生命科学研究中的焦点，在2001和2002年连续两年被((Science))杂志
评为自然科学十大突破之一。作为一项高效率高特异性的基因封闭技术，RNAi
近年来已成为分子生物学研究的主要技术手段之一，在基因功能研究、基因治
疗、基因表达调控等方面有着非常重要的应用。
RNAi的作用机制目前已经比较清楚。它是由双链RNA介导，在转录后水
平通过与mRNA特异性互补结合产生的特异性mRNA降解从而关闭相应基因表
达的过程，是序列特异性的转录后基因沉默(posttranscriptional
gene
silencing
PTGS)，具有以下重要特征：(1)RNAi属于转录后水平的基因沉默机制，迄今
为止的研究认为RNAi对染色体DNA序列的复制和转录过程不产生任何影响。
(2)具有高度的序列特异性，将人工合成的siRNA(small
interfere
RNA)转入宿
主细胞的实验表明，即使siRNA中只有一个碱基与靶序列错配，也会使干涉效
应大大减弱。(3)具有抑制基因表达的高效性，可以引起该基因缺失突变的表
型；而且远远少于内源mRNA数量的dsRNA就可以实现完全的抑制效应，即其
发生过程中存在着正反馈的信号放大效应。(4)RNAi的效应可以在不同细胞间
长距离传递和维持，而且在某些生物中(如线虫)具有遗传性。
RNAi的作用途径包括启动阶段和效应阶段。在启动阶段，进入细胞的
dsRNA在其特异性的核酶Dicer的催化下被逐步切割为21．23nt的小片段干扰
RNA
siRNA，每个siRNA分子包括19．2Int的互补双链及两侧3’末端的2nt悬出
端。在RNA依赖的RNA聚合酶催化下，以siRNA为引物，目的mRNA为
模板
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合成大量新的dsRNA，进入新的循环，因而仅仅几个dsRNA分子即可产生强大
的干扰效应。进入效应阶段后，siRNA结合于另一核酶复合体RISC(RNA—induced
silencing
complex)，在ATP供能下siRNA双链解旋，RISC激活，借碱基互补原
则锚定于同源的mRNA转录本上，最后核酶从siRNA反义链3’端开始，降解
mRNA。降解产物又可以与siRNA反义链结合，形成新的siRNA，引起新一轮
mRNA降解，所以这一过程具有正反馈级联放大效应，一旦启动反应迅速进行，
将相应的mRNA全部降解而完全抑制该基因的表达。
天津医科大学硕士学位论文
目前获得siRNA主要有三种方法，化学合成、体外酶法合成和体内转录。
化学法和体外酶法是直接合成siRNA，体内转录法主要是构建一个能在体内表
达的表达框，在体内分别转录有义RNA和反义RNA，两条链在细胞内互补结合
生成siRNA，或者构建一个转录短发卡RNA(short
hairpin
RNA，shRNA)的表
达框，shRNA在宿主细胞被转录后，两段互补序列碱基配对结合，中间序列则
成为茎环结构。茎环结构可被Dicer酶识别并切除，产生的siI玳A将执行RNA
干扰。后者比较常用。
RNAi的实现方法有很多，如直接转染合成的siRNA、利用质粒载体或病毒
载体等。直接转染法细胞内的siRNA很容易被降解，质粒载体能在细胞内长时
间、稳定地生成siRNA，但其转染哺乳动物细胞的效率还是无法令人满意，特
别是不能转染非分裂相细胞。病毒载体，特别是慢病毒载体，免疫原性低，能
感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组，能在
哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达，是实现RNAi比较理想
的载体，本实验就是利用慢病毒介导的RNA干扰方法。
RNAi技术有许多独特的优点：与反义技术相比，具有高效性和特异性；与
基因敲除技术相比，具有投入少、周期短、操作相对简单的优势，可以快速地
实现特定基因的“沉默’’，
Zhu等巧1用d
1,3GT特异siRNA转染猪血管内皮细
胞，转染后48
h
a
1,3GT表达量减少了约70％，a
Gal相对表达水平降为10．5
％"--32．7％，天然抗体辟}、体结合水平下降程度为IgG44．8％，IgM68．1％，C3e51．4
％，正常人血清对siRNA转染的细胞杀伤较对照组下降59．8％"-'69．5％，有效
地减轻了细胞损伤。永生化猪血管内皮细胞系PED在转染SiRNA．1后确实发生
了基因沉默，a
1,3．GT基因下游的酶解产物a
Gal的合成明显减少，在流式细胞仪
上表现为平均荧光强度显著低于对照组(P0．05)。RNAial，3GT+NF—r．B组异种移植物排斥反应较
RNAial，3GT减轻但移植物平均存活时间没有进一步延长(p>0．05)，可能因HAR
尚未得到完全控制有关，其具体机制有待进一步研究。
4．小鼠到大鼠异种异位心脏移植模型排斥反应特点
小鼠与大鼠的亲缘关系相对较近，因此小鼠对大鼠异种异位心脏移植模型属
于协调性异种移植，文献“刀报道移植供心存活时间平均2．7天。而本实验中采用
Balb／cdx鼠供心移植到F344大鼠右侧颈部，移植后(32±2．5)小时，小鼠供心被
排斥而失去功能，与文献报道不一致，可能是移植模型所用动物种属不同所致。
本实验中Balb／cdx鼠供心移植到F344大鼠右侧颈部平均存活时间为(32±2．5)小
时，HE染色显示被排斥心脏间质出血、水肿、多数血管内有血栓形成，尤其以
大血管明显，部分心肌坏死崩解符合超急性排斥反应病理特点见图2。免疫组化
检测发现补体C3、IgM、IgG在移植物中明显沉积见图5、图7、图9，NK细胞在植
物物有较少量表达，巨噬细胞在植物中少量表达，且ICAM-1在对照组有阳性表
达。NK细胞、巨噬细胞的浸润是急性血管性排斥反应(AVR)的病理特点，说明
Balb／ed'、鼠到F344大鼠颈部心脏移植排斥反应中也存在急性血管性排斥反应成
分，但起辅助作用。
慢病毒介导RN^干扰小鼠供心a
l，3GT，减少甚至消除异种抗原Gal
a
(1,3)Galt拘量，减少预存天然抗体(XNA)与供心表面异种抗原Gal
a(1,3)Gal结
合，抑制了补体系统的激活，RNAi
a
l，3GT组移植物HE染色示间质大量的单
核细胞浸润，伴间质出血、微血栓形成见图3。免疫组化SABC法检测可见补体
C3、IgM、IgG在移植物中沉积较对照组减少，NK细胞、巨噬细胞浸润较对照组
天津医科大学硕士学位论文
增多，出现NK细胞、巨噬细胞明显浸润说明慢病毒介导RNA干扰小鼠供心Q
1，
3GT使Balb／cd、鼠至UF344大鼠颈部心脏移植排斥反应渡过了超急性排斥反应，出
现了急性血管性排斥反应(AVR)的病理改变。此时NK细胞、单核巨噬细胞成为
免疫反应的主要成员，但实验数据也表明HAR与AVR间并无绝对的时间界限，
是一个逐渐过渡的过程。在过渡过程中NK细胞、巨噬细胞的浸润增加，移植物
的存活时间延长，NK细胞、巨噬细胞的浸润与移植物存活时间成正相关(p<0．05)。
5．展望
研究者们对如何成功克服HAR进行了深入的研究，如免疫抑制剂的应用和清
除抗Q
Gal的抗体，但目前认为敲除Q
l，3GT基因是控制HAR最为有效的方法，
近年来，Lai口1和Phelps
H3等报道他们成功培育出了Q
l，3GT基因敲除猪。然
而，大型哺乳动物的基因敲除技术仍存在许多技术屏障，且费时多，耗费大，
成功率低，目前世界上仅有少数几家科研机构能拥有此项技术，这就使得研究
者们为寻找快速、便捷的方法而努力。RN
A干扰(RNAi
nterference，R
NAi)是
正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性
mRNA编码区同源的双链RNA(doublestranded
RNA，dsRNA)时，该内源性mRNA
发生降解而导致基因表达沉默的现象。随着对RNA干扰研究地深入，人们逐渐
认清了RNA系统在细胞内基因表达中的调控作用，这种技术不但成为研究基因
功能的重要工具，而且在病毒感染、免疫性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的
治疗方面发挥了重要的作用。
如果能利用RNAi技术，通过基因沉默的方式，用针对Q(1，3)GT基因的
siRNA，可望实现特异地干扰(It(1，3)GT的生成，从而减少Gal
Q(1，3)Gal的目
的，控制超急性排斥反应。特异性地抑制NF-KB的表达，从而实现对血管内皮细
胞激活的调控，为有效克服HAR、AVR提供可靠的手段。器官移植的最终发展
趋势将逐渐走向动物器官移植到人类，通过基因工程和RNA干扰供者器官的方
法，使异种器官移植的广泛开展成为可能。
35
天津医科大学硕士学位论文
小结
本实验通过改良Heron套袖法建立小鼠一大鼠异种异位心脏移植模型，利用
RNA干扰方法抑制供心Q
1，3GT、NF-K
B表达，按照RNA干扰供心靶基因不同分
组，观察各组供心存活时间变化，并应用SABC法检测C3、IgM、IgG、NK细胞、
巨噬细胞、ICAM-1在失功心脏中沉积变化情况。实验结果如下：
对照组、空病毒组、RNAial，3GT组、RNAiNF．r．B组、RNAial，3G”-NF一1cB
组异种移植物的平均存活时间分别为(32士2．5)h，(31士2．5)h，(51士4．o)k(31士1．8)h，
(53士7．3)h．对照组、空病毒组、RNAiNF．r,B组三组移植物生存时间无明显差别
(p>O．05)，RNAial，3GT组、RNAial，3GT+NF．rd3组移植物生存时间较对照组、
空病毒组、RNAiNF．rB组明显延长0<0．05)，RNAial，3GT组、RNAial，3GT+
NF．r．B组两组移植物生存时间无明显差别(p>0．05)。
SABC法检测补体C3、IgM、IgG在对照组、空病毒组、RNAi
NF．rB组三组
均可见大量沉积，且三组间无明显差别(p>0．05)。RNAial，3GT组、RNAial，3GT
时吓．1(B组补体C3、IgM、IgG沉积较对照组、空病毒组、RNAiNF．r．B组减少
O<0．05)，RNAial，3GT组、RNAial，3GT+NF-r．B组两组间补体C3、IgM、[gG沉
积无明显差别(p>0．05)；NK细胞、巨噬细胞、ICAM．1在对照组、空病毒组、
RNAiNF．心组三组有阳性表达，且三组间无明显差别(p>0．05)，在RNAial，3GT
组、RNAial，3GT+NF．r,B组浸润表达较对照组、空病毒组、RNAiNF—r．B组增加
(p
方案
气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载
，AVR
正日渐成为影响异种移植物存活的主要障碍，今后克服AVR的研究方向将继
续集中在对AVR发生机制更深层次的研究，相应分子生物学、转基因技术及
RNA干扰技术同步发展与实用化探索。
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天津医科大学硕士学位论文
致谢
三年的学习、工作、生活已告一段落，在此论文完成之际，首先表达对我
尊敬的导师：朱理玮教授、戚峰副教授由衷的感谢。感谢恩师三年来对我的孜
孜不倦的教诲，在我临床工作、实验研究、论文撰写过程中得到了导师的悉心
指导和热忱帮助，在此真诚的感谢。特别对导师在我工作和生活方面的无私帮
助表达我最真挚的谢意和最衷心的感谢。导师高尚的人格情操、严谨的治学精
神、渊博的学识，将是我一生学习的方向，会使我受益终生。
在实验室的学习和工作、生活中得到了王鹏志教授的诸多教诲和莫大的帮
助，在此表示最诚挚的感谢。
衷心感谢梁晓宇、逯宁、何向辉、王金录、赵春华、戚峰、冯舟、刘刚、
戴向晨、罗宇东等各位老师等带教老师在我临床工作及实验过程中的悉心教导
和耐心帮助。
感谢普通外科研究所赵娜老师、邱宇杰老师、梁晖老师在一年的实验过程
中给予的无私的技术指导和鼓励。
感谢普外科所有医护人员给予我的帮助和教导，感谢在实验室做课题的各
位同学给予的大量协助。
最后感谢我的家人多年来对我的培养教育以及在我实验课题期间予以的理
解、鼓励和支持!
二oo九年五月
浙公网安备 33021202002483