培美曲塞诱导神经管畸形动物模型及其机制研究（可编辑）

培美曲塞诱导神经管畸形动物模型及其机制研究（可编辑） 分 类 号 : 单 位 代 码 : 1 0 1 1 4 密 级 : 学 号 : D 2 0 0 9 0 2 7 培 美 曲 塞 诱 导 神 经 管 畸 形 动 物 模 型 及 其 机 制 的 研 究 研 究 生 : 赵 婕 指 导 教 师 : 牛 勃 教 授 合 作 指 导 教 师 张 霆 教 授 申 请 学 位 门 类 级 别 : 理 学 博 士 专 业 名 称 : 生 理 学 研 究 方 向 : 发 育 分 子 生 物 学 所 在 学 院 : 基 础 医 学 院 二 ? 一 三 年 五 月 五 日目 录 前 言 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 8 第 一 部 分 培 美 曲 塞 诱 导 神 经 管 畸 形 小 鼠 模 型 的 建 立 ? ? ? ? ? ? ? 1 2 1 前 言 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 2 2 材 料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 3 21 实 验 动 物 来 源 及 饲 养 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 3 22 实 验 试 剂 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 3 23 实 验 器 材 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 3 24 溶 液 配 制 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 4 3方 法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 4 31 神 经 管 畸 形 动 物 模 型 的 建 立 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 4 32 取 材 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 5 33 组 织 病 理 检 测 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 5 4结 果 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 7 5讨 论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 0 第二 部分 P MX 诱导 神经 管畸形 小鼠 胚胎中 叶酸 及其代 谢产物 的 改 变 1前 言 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 4 2 . 材 料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 5 21 实 验 动 物 来 源 及 饲 养 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 5 22 实 验 动 物 分 组 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 5 23 主 要 仪 器 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 6 24 试 剂 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 63 . 实 验 方 法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 6 31 高 效 液 相 色 谱 方 法 检 测 叶 酸 及 代 谢 产 物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 6 32 E L I S A 方 法 检 测 叶 酸 的 含 量 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 7 33 D H F R 的 活 性 测 定 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 9 34 叶 酸 代 谢 过 程 关 键 酶 的 m R N A 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 水 平 测 定 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 0 35 统 计 学 分 析 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 1 4 . 实 验 结 果 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 1 41 高 效 液 相 色 谱 方 法 检 测 P M X 对 叶 酸 及 相 关 代 谢 产 物 水 平 的 影 响 ? ? ? 3 1 42 E L I S A 方 法 检 测 P M X 对 叶 酸 水 平 的 影 响 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 2 43 P M X 降 低 神 经 管 畸 形 小 鼠 胚 胎 的 D H F R 活 性 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 3 44 亚 甲 基 四 氢 叶 酸 还 原 酶 ( M T H F R ) 和 腺 苷 酸 合 成 酶 ( T S ) 的 m R N A 表 达 3 4 5讨 论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 5 第三 部分 P MX 诱导 神经 管畸形 小鼠 胚胎基 因组 拷贝数 变异的 检 测 及变异 基因 的筛 选 1 前 言 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 9 2 材 料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 1 21 实 验 动 物 来 源 及 饲 养 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 1 2 .2 实验 仪器 ?? ?? ??? ?? ??? ?? ??? ??? ?? ??? - -41 23 实 验 试 剂 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 1 3 实 验 方 法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 2 31 实 验 动 物 分 组 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 2 3 .2 a CG H 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 检测 小鼠胚 胎基 因组拷 贝数 变异 ?? ?? ??? ?? ??? 4 2 3 .3 全基 因组 表达谱 芯片 技术筛 选 P MX 诱导 的 N TD s 小鼠 胚胎 组织变 异基 因 - 44 3 .4 R T- PCR 检验 变异 基因变 化水 平 ?? ?? ??? ?? ??? - -- --- -4 735 统 计 学 分 析 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 8 4 实 验 结 果 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 8 41 a C G H 方 法 检 测 筛 选 出 拷 贝 数 变 异 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 8 4 .2 表达 芯 片 R N A 质量 检测 结果 ?? ?? ??? ?? ??? ?? ??? 4 9 44 数 据 分 析 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5 0 4 .5 S AM 软件 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 结果 ?? ?? ??? ?? ??? ?? ??? ??? ?? 53 4 .6 R T- PC R 方法 验证 基因筛 选结 果 ?? ?? ??? ?? ??? ?? ??? 5 7 5 讨 论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5 8 第四 部分 P MX 诱导 N TD s 动物 模型 中胚胎 干细 胞 D NA 的改 变 1 前 言 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 3 2 材 料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 5 21 细胞 来源 及主要 试剂 ?? ?? ??? ?? ??? ?? ??? ?? - -- - 65 22 主 要 仪 器 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 5 23 试 剂 的 配 制 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 5 3 实 验 方 法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 6 31 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 培 养 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 6 32 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 E S C 的 传 代 及 冻 存 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 6 33 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 E S C 的 给 药 及 处 理 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 6 34 D H E 荧 光 探 针 检 测 细 胞 内 活 性 氧 ( R O S ) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 6 35 单 细 胞凝 胶 电 泳实 验 (彗 星 实验 ) ? ? ?? ? ? ?? ? ? ? ?? ? ? ? 6 7 36 细 胞 内 G S H 和 M D A 含 量 的 测 定 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 8 37 统 计 学 分 析 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 7 1 4 实 验 结 果 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 7 1 41 P M X 诱 导 S V 1 2 9 E S C 细 胞 中 R O S 水 平 明 显 上 调 ? ? ? ? ? ? ? ? 7 1 4 .2 P MX 诱导 S V1 29 E SC 细胞 中 D NA 损伤 明显 增加 ?? ?? ??? -- -- --- -7 2 4 .3 E LI SA 方法 检测 P MX 增加 胚胎 干细胞 内 G SH 和 M DA 的含 量 ?? ?? - -- 74讨 论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 7 5 全 文 小 结 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 7 8 结 论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 8 0 综 述 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 8 1 参 考 文 献 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 9 0 攻 读 博 士 学 位 期 间 发 表 的 文 章 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 0 2 致 谢 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 0 3 个 人 简 历 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 0 4山西医科大学博士学位 论文 培 美 曲 塞 诱 导 神 经 管 畸 形 动 物 模 型 及 其 机 制 的 研 究 摘 要 研 究 目 的 : 本 研 究 利 用 抗 叶 酸 代 谢 药 培 美 曲 塞 ( P M X ) 对 C 57B L / 6J 孕 鼠 进 行 药物 干预 ,通过 对孕 鼠胚胎 形态学 观察 及其他 指标 的检测 ,筛 选 出最 佳的 给药 剂 量 和 时 间 , 建 立 叶 酸 代 谢 障 碍 的 C 57B L / 6J 小 鼠 胚 胎 神 经 管 畸 形 ne ur a l t ube de f e c t s , N T D s 动物模 型 ; 采用微 阵列比较基 因组杂交技术 a C G H 检测 P M X 诱 导 N T D s 模型基因组拷贝数变异; 应用全基因组表达谱 芯片技术检测 P M X 诱导 N T D s 模型的基因表达 谱 , 筛选可能的 P M X 引起 N T D s 的致病基 因;初 步探 讨 P M X 对 N T D s 发生发展的影响及相关发病机制的研究。 研究 方法 :本研究中 将 7~8 周健康雌性 C 57B L / 6J 小鼠随机分两组受孕, 给药 实 验 组 于 孕 7.5 ( E 7.5 ) 天 腹 腔 注 射 P M X , 摸 索 适 当 的 给 药 剂 量 并 建 立 神 经 管 畸形动物模型, 正常对照组按体重注射同等剂量的生理盐水 。 在孕 1 1 .5 (E 1 1 .5 ) 天, 颈椎 离断 处死实 验组 和 正常 对照 组 孕鼠 ,取 胚胎 于在解 剖显 微镜下 观察 胚 胎神 经管 畸形的 外部 特征; 经固定 、切 片、染 色后 ,光镜 下观 察畸胎 情况 及神 经 管 形 态 改 变 ; 高 效 液 相 色 谱 法 首 先 测 定 P M X 干 预 孕 鼠 的 不 同 时 间 点 的 叶 酸 及代谢产 物水平; E L I S A 方法检测 P M X 诱导的 E 7.5 天胚胎组 织叶酸水平;测 定胚胎组织的二氢叶 酸还原酶 (D H F R ) 活性; R T - P C R 法检测胚胎组织叶酸 代 谢 途 径 关 键 酶 的 基 因 表 达 水 平 。 应 用 高 分 辨 微 阵 列 比 较 基 因 组 杂 交 技 术 检 测 P M X 诱导小鼠 N T D s 模型基因组拷贝数变 异 , 经过生物信息学 U C S C 比对并应 用 R T - P C R 分 析 ; 应 用 全 基 因 组 表 达 谱 芯 片 技 术 高 通 量 筛 选 出 在 N T D s 小 鼠 胚 胎中异常表达的基因, 并对这些差异表达基因 进 行 G O 分析, 对所筛选出 的 P t c h 1 基因 、 E ndog 基因进行 R T - P C R 方法进行验证 。 体外实验检测 P M X 对小鼠胚胎 干 细 胞 氧 化 应 激 损 伤 ; 应 用 单 细 胞 凝 胶 电 泳 方 法 检 测 P M X 对 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 的 D N A 损伤的影响。 研究 结果 : 1. P M X 具 有明 显 的 胚胎 致 畸性 , 可 导致 孕 鼠 子宫 明 显充 血 、 淤血 , 大体 外 观 1山西医科大学博士学位论文 可 见吸 收 胎 、 胎 鼠发 育 迟缓 及 N T D s 形 态表 现 , H E 染 色可 见 N T D s 胎 鼠后 脑泡未闭合。 2. E 7.5 天注射 P M X 后, 在 4、12 小时 孕鼠 血中叶 酸明显 高于 正常 ,24 、96h 接近于正常 水平 ; 5- F oT H F 变化不 大 , 5- M e T H F , ,S A M , S A H 四个指 标表现 不 同 程 度 的 降 低 , 在 24h 开 始 慢 慢 恢 复 , 但 96h 仍 低 于 正 常 水 平 , 具 有 统 计学意义 p < 00 5 。 , 同时 P M X 明显降低实验组的胚胎组织 叶酸水 平 。 D H F R 活性在 4~8 小时后降到最低,仅为正常 小鼠胚胎组织的 15% ,随后 D H F R 的活性开始恢复, 但是在 P M X 注射 24 小时后, D H F R 活性仍然低于正常水 平。 实验组小鼠胚胎组织结果显示实验组小鼠胚胎组织亚甲基四氢叶酸还原 酶 ( M T H F R ) 和腺苷酸合 酶 (T S ) 的 m R N A 表达水平低 于对照组小鼠胚胎 组织(p 0.05 ) 。 3. 应 用 高 分 辨 微 阵 列 比 较 基 因 组 杂 交 技 术 ( A r r a y c om pa r a t i ve g e nom i c hy b r i di z a t i on, a C G H ) 对 N T D s 小 鼠 胚 胎 基 因 组 拷 贝 数 变 异 ( C opy num be r va r i a t i ons , C N V s )进行检测, 结果显示共筛选出 313 个拷贝数变异 片段 , 包 含 101 个变异基因。 在表达谱中筛选出的差异表达基因共 165 个, 表达上调 的基因有 96 个, 表达下调的基因有 69 个。 这些与正常组织表达有差异基因 包括代谢相关基因;发育相关基因;信号转导相关基因;转录相关基因 ; 物 质转运相关基因;应激相关基因;离子转运相关基因;细胞凋亡相关基因 ; 细胞增殖相关基因; 细胞分化相关基因 ; 细胞粘附相关基因 ; 细胞周期 相关 基因等。其中 R T - P C R 验证结果与表达谱芯片结果一致( p 0.05 ) 。 4. 单 细 胞 凝 胶 电 泳 结 果 显 示 P M X 对 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 D N A 有 损 伤 , 并 且 有 剂 量依赖性。 随着 P M X 浓度的增加 , D N A 拖尾越明显; 同时造成小鼠胚胎干 细胞的氧化应激损伤。 结论 : 1. P M X 能成功的诱 导 C 57B L / 6J 小鼠胚胎N T D s , 是一种接近 人类的 N T D s 的动物 模型。 2山西医科大学博士学位论文 2. 抗 叶 酸 代 谢 药 P M X 可 以 抑 制 小 鼠 叶 酸 及 其 相 关 产 物 的 代 谢 , N T D s 胚 胎 发 生 基因组拷贝数变异。 3. P t c h1 基 因 的 上 调 和 E ndog 基 因 表 达 的 下 调 在 P M X 致 N T D s 的 发 生 过 程 中 发 挥 重要作用,可能是P M X 致N T D s 发生的候选基因。 4. 体外实验中, P M X 可以损伤小鼠胚胎干细胞 D N A , 造成小鼠氧化应激损伤, 使胚胎干细胞发生凋亡,最终使神经管不能发生正常闭合,而导致神经管畸 形的发生。 关键 词 : 培美曲塞; 神经管畸形 ; 叶酸代谢 ; 高效液相色谱; D N A 损 伤; 氧化 应激 3山西医科大学博士学位论文 S t u d y o n a n i m a l m o d e l o f n e u r a l t u b e d e f e c t s i n d u c e d b y P M X a n d i t s m e c h a n i s m s A b s t r ac t O b j e c t i ve : T hi s s t udy a i m s t o i nve s t i g a t e t he e f f e c t s of P M X on t he de ve l opm e nt of N T D s a nd e x pl or e i t s pa t hoge ne s i s by us e of a hi g h- t houg hput g e ne c hi p t e c hnol ogy , a r r a y - c om pa r a t i ve g e nom i c hy b r i di z a t i on a C G H t o de t e c t t he c opy num be r va r i a t i ons C N V i n P M X - i nduc e d N T D s a nd t he g e nom e - w i de e x pr e s s i on m i c r oa r r a y t o de t e c t g e ne e x pr e s s i on pr of i l e s i n N T D e m br y o s a nd s e l e c t t he pot e nt i a l m or bi f i c g e ne s t o N T D sM e t h od : A ni m a l m ode l of ne ur a l t ube de f e c t s N T D s a s s oc i a t e d w i t h f ol a t e dy s m e t a bol i s m w a s i nduc e d by i nt r a pe r i t one a l i nj e c t i on of pe m e t r e x e ddi s odi um P M X i nt o C 57B L / 6J pr e gna nt m i c eH e a l t hy a dul t f e m a l e C 57B L / 6J m i c e 7 ~ 8 w e e ks ol d w e r e r a ndom l y di vi de d i nt o t w o g r oups f or c onc e pt i on. T he pr e gna nt m i c e i n e x pe r i m e nt g r oup a nd c ont r ol g r oup w e r e t r e a t e d by i nt r a pe r i t one a l i nj e c t i on of P M X w i t h t he opt i m a l dos e a nd nor m a l s a l i ne w i t h t he s a m e dos e , r e s pe c t i ve l y on g e s t a t i on da y G D 7.5. T he pr e gna nt m i c e w e r e s a c r i f i c e d on G D 1 1 .5 i n bot h g r oups a nd t he c ha r a c t e r i s t i c s of t he f e t us e s w e r e c a r e f ul l y obs e r ve d unde r a di s s e c t i ng m i c r os c opeS om e a bnor m a l f e t us e s w e r e f i x e d, s l i c e d a nd s t a i ne d t o obs e r ve t he t y p e a nd m or phol og i e s of ne ur a l t ube de f e c t s unde r m i c r os c opeW e us e d hi g h pe r f or m a nc e l i qui d c hr om a t ogr a phy H P L C m e t hod t o de t e c t t he s e r um l e ve l s of f ol a t e a c i d a nd i t s m e t a bol i c pr oduc t s i n pr e gna nt m i c e t r e a t e d by P M X i n di f f e r e nt t i m e poi ntE nz y m e - l i nke d i m m unos or be nt a s s a y E L I S A w a s us e d t o de t e r m i ne t he e m br y o t i c l e ve l s of f ol i c a c i d on G D 1 1 .5 of pr e gna nt m i c e t r e a t e d by P M X a nd ,t he D H F R a c t i vi t y i n P M X t r e a t e d e m br y o s w a s t e s t e d by D i hy d r of ol a t e R e duc t a s e A s s a y K i tB e s i de s , R T - P C R w a s us e d t o de t e c t t he g e ne e x pr e s s i ons of 4山西医科大学博士学位论文 ke y e nz y m e s i n f ol i c a c i d m e t a bol i c pa t hw a yF ur t he r m or e , hi g h- t houg hput g e ne c hi p t e c hnol ogy w a s a ppl i e d t o s c r e e n di f f e r e nt i a l l y e x pr e s s e d g e ne s of e m br y o be t w e e n nor m a l m i c e a nd N T D m i c eG O a na l y s i s w a s us e d t o a na l y s e t he di f f e r e nt i a l l y e x pr e s s e d g e ne sW e a l s o us e d R e a l t i m e - P C R t o va l i da t e t he di f f e r e nt i a l l y e x pr e s s e d g e ne s , i nc l udi ng P t c h1 a nd E ndogF i na l l y , oxi da t i ve da m a ge s i n m ur i ne e m br y o ni c s t e m c e l l s c a us e d by P M X w e r e m e a s ur e d i n vi t r o a nd s i ng l e c e l l g e l e l e c t r ophor e s i s w a s us e d t o de t e r m i ne t he D N A da m a ge s i nduc e by P M XR e s u l t s 1. P M X c a us e d s i g ni f i c a nt e m br y o m a l f or m a t i ons i n pr e gna nt m i c e w hi c h pr e s e nt e d obvi ous hy p e r e m i a i n ut e r usA bs or pt i ve f e t us , hy p oe vol ut i s m a nd N T D s of e m br y o s w e r e f ound unde r a na t om y s c opeH E s t a i ni ng s how e d t ha t t he e m br y o ni c hi ndbr a i n w a s not c l os e d. 2. A f t e r i nt r a pe r i t one a l i nj e c t i on of P M X i nt o pr e gna nt m i c e on G D 7.5, s e r um l e ve l s of f ol a t e a c i d i nc r e a s e d s i g ni f i c a nt l y a t 4 hour a nd 12 hour a nd r e duc e d t o nor m a l a t 24 hour a nd 96 hourN o s i g ni f i c a nt c ha nge s of 5- F oT H F w e r e f ound. B ut l e ve l s of 5- M e T H F , S A M a nd S A H de c r e a s e d s i g ni f i c a nt l y a nd be ga n t o r e c ove r a t 24 hour , but s t i l l s i g ni f i c a nt l y l ow e r t ha n nor m a l a t 96 hour P 0.05B e s i de s , f ol a t e l e ve l s i n e m br y o t i c t i s s ue s w e r e a l s o s i g ni f i c a nt l y r e duc e d by P M X t r e a t m e ntD H F R a c t i vi t y i n e m br y o w a s r e duc e d t o t he l ow e s t l e ve l a t 4- 8 hour , w hi c h i s onl y 15% of D H F R a c t i vi t y i n nor m a l e m br y oA f t e r t he n, D H F R a c t i vi t y be ga n t o r e c ove r , but w a s s t i l l l ow e r t ha n t ha t i n nor m a l e m br y o a t 24 hourR T - P C T s how e d t ha t t he m R N A e xpr e s s i ons of 5,10- m e t hy l e ne t e t r a hy d r of ol a t e r e duc t a s e M T H F R a nd t hy m i dy l a t e s y n t ha s e T S w e r e s i g ni f i c a nt l y de c r e a s e d by P M X t r e a t m e nt p 0.05 3. A r r a y c om pa r a t i ve g e nom i c hy b r i di z a t i on, a C G H a s s a y s e l e c t e d 313 C N V f r a gm e nt s , i nc l udi ng 101 m ut a t e d g e ne s165 di f f e r e nt i a l l y e x pr e s s e d g e ne s w e r e 5山西医科大学博士学位论文 s c r e e ne d by t he hi g h- t hr oughput g e ne c hi p t e c hnol ogy i n N T D m i c e , i nc l udi ng 96 up- r e gul a t e d g e ne s a nd 69 dow n- r e gul a t e d g e ne sG O a na l y s i s s how e d t ha t t he di f f e r e nt i a l l y e x pr e s s e d g e ne s i nvol ve d i n va r i ous m e t a bol i s m s i nc l udi ng c e l l ul a r m e t a bol i c pr oc e s s , de ve l opm e nt pr oc e s s , s i g na l t r a ns duc t i on, t r a ns c r i pt i on, m a t e r i a l t r a ns por t a t i on, s t r e s s r e s pons e , i on t r a ns por t a t i on, c e l l a popt os i s , c e l l pr ol i f e r a t i on, c e l l di f f e r e nt i a t i on, c e l l a dhe s i on, c e l l c y c l e , e t a lT he r e s ul t s of R T - P C R w a s i n a c c or da nc e w i t h t ha t of t he g e ne c hi p t e c hnol ogy p 0.054. R e s ul t s of s i ng l e c e l l g e l e l e c t r ophor e s i s s how e d t ha t P M X c a us e d di r e c t D N A da m a ge s i n m ur i ne e m br y o ni c s t e m c e l l s i n a dos e - de pe nde nt m a nne rA s t he c onc e nt r a t i on of P M X i nc r e a s e d, D N A t r a i l i ng be c om e m or e obvi ous , l e a di ng t o obvi ous oxi da t i ve s t r e s s i nj ur i e s i n m ur i ne e m br y o ni c s t e m c e l l sC on c l u s i on 1. A ni m a l m ode l of N T D s w a s s uc c e s s f ul l y e s t a bl i s he d by P M X i n C 57B L / 6J m i c e , w hi c h i s a n m ode l s i m i l a r t o hum a n N T D s2. A nt i - f ol a t e dr ug, P M X c a n i nhi bi t f ol a t e a nd i t s r e l a t e d m e t a bol i s m s i n pr e gna nt m i c e a nd i nduc e C N V i n N T D s3. U p- r e gul a t i on of P t c h1 a nd dow n- r e gul a t i on of E ndog bot h pl a y pi vot a l r ol e s i n t he de ve l opm e nt of N T D s a nd t he s e t w o g e ne s m a y be t he c a ndi da t e g e ne s f or P M X - i nduc e d N T D s4. P M X c a us e d D N A da m a ge s i n m ur i ne e m br y o ni c s t e m c e l l s , oxi da t i ve s t r e s s i nj ur i e s of m i c e a nd a popt os i s of e m br y o ni c s t e m c e l l s , l e a di ng t o a bnor m a l c l os ur e of ne ur a l t ube a nd ul t i m a t e l y N T D sK e yw or d s : P e m e t r e x e ddi s odi um P M X ; N e ur a l t ube de f e c t s N T D s ; f ol a t e m e t a bol i s m ; H P L C ; D N A da m a ge ; oxi da t i ve s t r e s s6山西医科大学博士学位论文 英 文 缩 写 对 照 表 缩略语 全称 中文名字 P M X P e m e t r e x e ddi s odi um 培美曲塞 N T D s N e ur a l t ube de f e c t s 神经管畸形 D H F R di hy d r of ol a t e r e duc t a s e 二氢叶酸还原酶 R T - P C R r e ve r s e t r a ns c r i pt a s e pol y m e r a s e c ha i n r e a c t i on 逆转录聚合酶链反应 G O G e ne O nt ol og y 基因本体论 F R f ol a t e r e c e pt or a l pha 叶酸受体 R F C 1 r e duc e d f ol a t e c a r r i e r 还原型叶酸载体 C B S c y s t a t hi oni ne B - s y n t ha s e 胱硫醚 B 合成酶 M T H F R 5,10- m e t hy l e ne t e t r a hy d r of ol a t e r e duc t a s e 5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶 M T R m e t hi oni ne s y n t ha s e 甲硫氨酸合酶 M T R R m e t hi oni ne s y n t ha s e r e duc t a s e 甲硫氨酸合酶还原酶 M T H F D 1 m e t hy l e ne t e t r a hy d r of ol a t e de hy d r oge na s e 亚甲四氢叶酸脱氢酶 胸苷酸合酶 T S t hy m i dy l a t e s y n t ha s e B S A B ovi ne S e r um A l bum i n 牛血清白蛋白 a C G H A r r a y c om pa r a t i ve g e nom i c hy b r i di z a t i on 微阵列比较基因组杂交技术 C N V s C opy num be r va r i a t i ons 拷贝数变异 E L I S A e nz y m e - l i nke d i m m unos or be nt a s s a y 酶联免疫吸附实验 S C G E S i ng l e c e l l g e l e l e c t r ophor e s i s 单细胞凝胶电泳 7山西医科大学博士学位论文 前 言 出生缺陷 bi r t h de f e c t s 是指胚胎或胎儿在发育过程中所发生的结构或功能 的发育异常,主要包括染色体异常,先天性发育畸形、先天性代谢紊乱等。婴 儿死亡率增加、 儿童和成人致残的主要原因之一是出生缺陷 。 神经管畸 形 ne ur a l t ube de f e c t s , N T D s 是由于在胚胎发育过程中 神经管未能完全闭合 而引起的一类 先天 性畸形,主要表现为脑和脊髓的畸形并常伴有颅骨和脊柱的 缺陷,继而涉 及 到一系列中枢神经系统及其他非神经系统的形态异常。它包括无脑畸形、脑 [ 1 ] 膨出 、 脑脊膨出、 脊柱裂等 。 N T D s 发病有明显的地区及种族差异, 我国属于 出生缺陷高发的国家,其发病率高约为1.3‰,后果严重。许多由于出生缺陷导 致的各种畸形均处于世界高发的水平,其中又以山西省为最高,特别是神经管 畸形 N T D s 患病率在山西省极为高发。N T D s 流行病学研究表明其在世界范围 内的发病率高发,是影响我国和世界人口素质的一种最常见和最严重 中枢神经 [ 2 ] 系统先天疾病之一 。最常见和最严重的N T D s 分别是无脑畸形 上神经孔关闭 不全 和脊柱裂 后神经孔关闭不全 。病因学研究表明,N T D s 的发病原 因极为复 杂,是由一系列遗传因素和环境(营养)因素相互共同作用而引发的。 多基因 遗传学研究表明,神经系统在胚胎发育的过程中遇到多种环境致畸性因素的干 扰而引发N T D s 的发病。由于N T D s 的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程, 因 此其机制目前尚未完全明确。N T D s 的发病机理研究已经进行多年。遗传因素与 环境因素及其相互作用是影响N T D s 发生的重要因素。研究人员一直在寻找导致 人类 N T D s 的候选基因。研究数据主要来源于生物化学和发育生物学途径、动物 模型以及定位候选基因三方面,这些数据提供了人类N T D s 的大量相关基因, 从功 能上来看,它们大致可分为两类: 一类为叶酸代谢及其相关基因,另一类为胚胎 发育相关基因。 [ 3 ] 叶酸是生物在发育生长过程中不可缺少的因素 之一 , 叶酸的功