低温保存肝细胞移植救治实验性急性肝功能衰竭

低温保存肝细胞移植救治实验性急性肝功能衰竭 低温保存肝细胞移植救治实验性急性肝功 能衰竭 生盐壁壁查!墼呈 低 32卷第10 温保存肝细胞移植救治实验性 急性肝功能衰竭 林雎侯宽承张文秀吕京宁周孝思型'.', ? 633 足卜7,; 寇丽筠 ^摘要本实验探讨了长期冻存肝细胞及其移植对急性肝功能衰竭的治疗作用.wistar鼠肝细胞在 液氮中冻存30,60,90和180天,其活率分别为冻前细胞的71—2,75?769?7和73—5,各冻存组 伺无显着差异}活的肝细胞内的谷草转氪酶等酶含量在各组间均无显着差异,光镜及电镜显示细胞结构 完整Sprague—Dawley鼠同种同基因冻存肝细胞移植可将急性肝功能衰竭鼠的存活率从118提高到5/ 7(P=0.035)结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,肝细胞在藏氮中保存,其活率并不随冻存时间的延长而降低,能保持活细胞结 构完整,酶古量正常并在肝功能衰竭的治疗中起作用. 关t调肝功能衰竭佩藏,细胞/\移遵,同种 随着肝细胞移植治疗肝功髓衰竭及先天性 代谢障碍性肝病在临床上的应用,首先遇到的 问题是肝细胞供需之间的矛盾如能将正常肝 细胞长期保存就可为II缶床移植及时提供充足的 细胞来源.Makowka等人用一7O?低温冰箱冷 嘞嘶锄,换淮南啄先镪5'3%,6o,保 存期长达120天不再进一步降低活力,并保持 其对肝功能衰竭竭的疗效作用.Maganto等 人将肝细胞保存在液氮(一196?)中2周,细胞 活率为53..本实验的目的是探讨长期保存 肝细胞并提高冻存后肝细胞的活率以及其在治 疗急性肝功能衰竭时所起的作用. 材料和方法 1.肝细胞悬液的制备及低温保存:成年雄性Wis— t大白鼠l2只,体重3o0,450g,切取肝左,右叶用 0.02己二胺四乙酸钠一Hanks液多点灌注法分离出 肝细胞,恻成单细胞悬液.计肝细胞总数.并用台盼蓝 拒染法测定细胞活率.将每只鼠游离出的肝细胞分成 五组IA组冻存30天lB组冻存60天Ic组冻存9o天I D组冻存180天,E组为新鲜对照.用含有10小牛血 清和1O二甲亚砜的RPMI一1640玲冻保存液将肝细 胞恻成浓度为2×10'个/ml的悬液.依次置于4?中 20分钟,一2O?中40分钟,40C中30分钟,一80? 中60分钟后直接放人液氮(一I96?)中贮存球存期 满时.迅遘取出玲冻的肝细瞻并置于4o?水褡中.解冻 复苏约2分钟,对肝细胞计数并测定活率. 2.肝细胞的形态,结构,组化及生化指标的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 : (1)细胞形志结构:光镜(HE染色)及透射电镜观察{ <趴温 (2)细胞组化:测定含糖原(GLY)++,+++一及葡 萄糖一6一磷酸酶(G6Pase)+一,+++的细胞百分数; (3)细胞生化:用10Triton和生理盐水各半将活的肝 细胞(2×10个/m1)制成匀浆,测定活的肝细胞内及 肝细胞释放八冻存藏中的谷草转氮酶(AST),乳酸脱 氢酵(LDH),碱性磷酸酶(ALP)和总蛋白(TPr) 3肝细胞培养:常规培养.肝细胞浓度为05×10 个/m[,培养48小时 4.急性肝功能衰竭模型的制作及肝细胞移植:供 体和受体均采用成年雄性SpragueDawley鼠(SD鼠). 体重肋O,250g肝功能衰竭手术r动物禁食12小时, 不禁水.在乙醚麻醉下,手术切除肝脏的8O左右.即 右侧叶,左侧叶及右中叶,造成鼠肝功能急性衰竭动 物随机分为两组:(1)移植组:8只.先将冻存3o天的4 ×10/2m1个活的肝细胞移植于受体脾内,3天后行肝 功能衰竭手术{(2)对照组:8只.受体脾内注射2m[生 理盐水,手术同上.两组实验鼠饲养观察1个月. 结果 1.肝细胞活率:肝细胞活率A组71.2土 11.2(i土,下同),B组75.7士13.9,c 组69,7?13.6%,D组73.5士l3.5%其活 率虽均比E组(92.7士3.7)显着降低(检 验,均P<O.05),但各冻存组间差异无显着性 意义(P>O.05). 2.细胞内成分,酶活性和释^冻存液中的 生化成分见表1,2. 1.北京医科大学第三医院外科100083 2.北京医科大学第兰医院检验科 表1不同时期的细胞内分成及酶活性 1994年lO月第32卷第l0 lA组B组lC蛆D组E组 lnl士士?土土 GLY()l11l81.3士10.812809?l421l87.9士6.Oll86.9士8.8l285.0?16.7 G6Pase()12f93.03-83l293.2?8O1l93.3?9.51196.0士2O789.1士121 AST儿)I8537.b士243.OlOL6g2.0士18501Ol4?0士459.O1O1392.0士147O8L322O?401.0 LDH(u/L)j836j士11.9942.9士17.4839.3?135lO509士15l633.7?8.7 ALP(u/L)l7l3.9士2.895.1士1.7l06.1士4.3l067士1.078.1?4.5 TPr(g/L)l8l3.1士1.01033士l_ll03.7士1.0l03.0士0.382.3?1.1 注:方差分析,P>O05 表2不同冻存时期细胞释放入冻存液中的生化成分 A组B组C组fD组项目 i士5土s土sI土 AST(u/L)8325.0士73.38297.O3-146.02450士8j.7l9267.0士27.3 IJ[)HU/L)l019.8-t-7.S1O23.2士8.826.7士7.5I9246士7.1 ALP(u/L)l02.2士1.8l01.7士133.0?2.21O25士0.9 TPr(g/L)l01.7士0.7101.6士041.6士O.9l101.6士0.2 注:方差分析,P>0.05 3.细胞组织学:(1)光镜:不同冻存期的细 胞解冻复苏后,其活细胞呈圆形,胞质丰富,胞 膜,核膜完整,糖原颗粒和G6Pase活性丰富.移 植组鼠脾内可见堆积和散在的成活肝细胞,井 有双核细胞.(2)电镜:冻存肝细胞与新鲜肝细 胞镜检比较无明显不同,具有丰富的细胞器和 多种内含物,质膜完好. 4.肝细胞培养结果:冻存180天的活细胞 培养48小时绝大多数贴壁牢固,呈圆形或椭圆 形,生长良好,与新鲜肝细胞培养后镜观形态无 任何区别. 5.移植动物存活率及存活情况:肝细胞移 植组鼠的存活率为5/7(另一只鼠因术中出血死 亡),显着高于对照组的i/8,(P一0.035).虽然 两组鼠行肝功能衰竭手术后,均精神欠佳,不欲 饮食,但移植组比对照组稍好两组鼠的死亡均 发生在肝功能衰竭后7天内以后,移植组的存 活鼠精神转好,饮食增加,手术1O天后与正常 鼠生活状况一样. 讨论 实验表明,肝细胞冻存3o天后,其活率为 71.2?13_.2,与冻前细胞活率(92.7士 3.7)相比,虽有显着降低(P<o.o5),但仍保 持在较高水平保存3O,6o,9o和180天之间的 细胞活率无显着性差异(尸>0.05).这说明将肝 细胞于一196?液氮中保存,在180天内其活率 并不随冻存时间的延长而降低.各冻存组之间 的肝细胞内G6Pase,AST,LDH,ALP活性和 GLY,TPr含量以及冻存液中AST,LDH,ALP 活性TPr含量均无显着差异(表1,2),进一步 证明在液氮中冻存肝细胞所造成的损害,是发 生在降温和复温时,而不是在冻存过程本身. 目前降温方法主要有两种,快速冷冻(降温 速度一100,一1000?/rain)和慢速冷冻(降温 速度一0.1,一1?/rain).根据"冰晶效应"和 .溶质损伤"学说,快速冷冻所造成的细胞损伤 是由复温过程中细胞内冰的再结晶,而慢速冷 冻的损伤主要是由于胞外高浓度溶液对细胞较 长时间的损害"所致.为了弥补快速降温和慢 速降温的不足,我们采用了中慢速降温法,平 均降温速度为一L5?/n,并注意保持降温梯 度的连续性我们认为在4o?水浴中复温比 37?好.这样可以加快复温速度,缩短复温时 间,减轻或尽量避免再结晶形成对细胞的损伤. 这也是提高冻存肝细胞存活率的重要措施之 光镜和电镜显示,冻存后活的肝细胞仍保 持其原有形态和超微结构的完整性,并含有丰 富的糖原颗粒和葡萄塘一6一磷酸酶活性,而经培 中华外科杂志1994年l0月第32卷第1O期 养后细胞生长状况良好.在此基础上,行冻存肝 细胞移植.在切除SD鼠的8O肝脏前3天,于 脾内移植4×10个冻存肝细胞,其存活率5/7 与对照组1/8相比显着增高(P一0.035).结果 表明,长期低温保存的肝细胞在体内仍可发挥 其生理功能.移植肝细胞发挥作用的可能机理, 一 是起暂时的肝脏支持作用,二是通过产生肝 细胞生长刺激因子促进病肝再生和功能恢 复".实验证明,液氮冷藏肝细胞能有效地保存 其正常的活力,结构及功能. ABSrRACT Studiesoflong—termeryopreservationofhepatocytes andtheirtransplantationtreatingacute~patlefailare inwistarratsLinCong,HouKuan-yong.ZhangWen- xiu?eta1.TbirdHospitalBeijingMedicdUniversi- ,Beifi'ng100083. Theexperimentaimedatstudyinglong-termcry opreservationofhepatocytesandtherapeuticeffectof theirtransp]antationforacutehepaticfailure.Hepat0 eytesofwistarratswerecryopreservedinliquidnitro— gentot30,60?9O,and180day暑.Theirviabilitieswere respectively71.2,75.7,69.7.and73.5of freshcells,however,therewerenosicnificantdiller. creesamongallcryopreservedgroups.Diflerencesof viablyintra—hepatocellularenzymecontentsamonga】J groups?suchasutamlcoxaloacetietransaminaseand soon,werenotsignificant.M0rpho】.gicallyintact hepatocyteswereobservedunderlightmicroscopyarm transn~ssionelectroncroscopy.Survivalrateof SpragueDawleyratswithacutehepaticfallurewerein creasedfrom1/8to5/7becauseofthetranspIantanon ofsyngeneicfrozenhep,~tocytes(尸一0.035).There- s~[tsshowedthatafter30daysoferyopreservationLn liquidnitrogen,theviabilityofhepatocytesdecreased significantly,hutnotongerdecreasedinsubsequent treezeuDt0180daysTheviabteintactcellsandtheir normalenzyrllecontentswerekept.Theacutehepatic failurecouldbetreatedbythem. 参考文献 1MakowkaL,RotsteinLE,FolkRE,etal…Rersa1of tOXiCandanoxJcinducedhepaticfailurebysyngeneie,atlo geneic,andxenogeneiehepatocytet一口Iancat1.n.Surg- ery,1980.88{244 2MagantoP,CieafuegosJA,SantamariaL,eta1.Auxiliary liverby~ansplantedfrozen-thawedhepatocytesJSurg Res,1990t4SI24 3.Sha~aBK,BaconB,BrittonRS,eta1.P…tionof hepatocyteinjuryandlipidperoxidationbyironc}Ielatots and?_toeopherolinisolatediron-loadedrathepatoeyte Hepatology,1990,12{31. 4.杨景山医学细胞化学与细胞生物拄术.北京北京医科大 学中国协和医科大学联合出版社,1?90;436~441 5.MakowkaL,RotstelnLE,FalkRE,eta1.Studiesiat.che mechan]smofyeversa]ofexperimental且cutehepat~failuTe byhepatocytetra~plantationCaaJSur8,198l,24;39 黄孝迈教授逝世 (收稿;1994Ol-24修回:1994O718) 中国共产党优秀党员,我国着名的胸心外科专家,中国人民解放军总医院专业技术一级,主任医师穗,授, 中华胸心血管外科学会常务委员,《中华外科杂志》常务编委黄孝迈同志,因病医治无效,于一九九四年六月五日十 二时四十五分在北京逝世,享年8o岁. 黄孝迈一九一四年十月二日出生于四川省成都市.一九四0年毕业于国立同济大学医学院.首任解放军胸科 医院外科副主任?解放军总医院胸外科主任,主任医师,教授,解放军总医院专家组组长等职务.还担任《美国医学 会》杂志中文版总编辑,《中华外科杂志》常务编委,《解放军医学杂志》编辑,《中华胸心血管外科杂志》副主编,国际 肺癌学会会员,解放军肿瘤专业组组长等社会职务.黄孝迈同意从1960年担任我杂志编委以来.为我们杂志社的 发展做了大量的工作.. 黄孝迈同志以积扳开拓进取的精神献身医学事业五十余载,贡献了毕生的精力.他博学多识,系统,广搓地了 解胸外科领域国内外发展状况,具有扎实的学科基础理论.在胸外科疾病的诊断和治疗方面积累了丰富的经验. 黄孝迈同志医德高尚?医风优良,他的一生是献身祖国,献身医学事业的一生,是垒心垒意为人民服务的一生, 是为共产主义事业奋斗的一生.他的逝世?是我国,我军医学事业的重大损失,他的 崇高品德将永远辙咄着我们. 黄孝迈同志永垂不朽!