氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关基因表达的影响
氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关
基因表达的影响
中国兽医2009年7月第29卷第7期砌JVetsJul.2009Vo1.29No.7885
氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关基因表达的影响
江鹏,张维东.,柴春彦,肖睿,丁明星.,刘国艳"(1.上海交通大学农业与生物学院,上海200240;
2.华中农业大学动物医学院,湖北武汉430070;3.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070)
摘要:为探讨氟对FRTL细胞甲状腺球蛋白(TG),甲状腺过氧化物酶(TP0)和钠碘转运体(NIS)基因表达的影响,
传代培养FRTL细胞,在对数生长期用氟化钠处理,使培养液中的氟浓度分别为20,10,5,2.5,1.25mg/I,同时设
空白对照细胞.培养72h后收集细胞;采用半定量RT—PCR分析FRTL细胞TG,TPO,NISmRNA和f3-actin表
达水平.试验结果表明,与对照细胞相比,较低浓度氟化钠处理的FRTL细胞TG基因表达量代偿性升高,随氟质
量浓度增加(5.0mg/L以上),TG表达量显着降低(P<0.05);各个浓度氟化钠处理的FRTL细胞TPO,NIS基因
表达量均下降或显着下降(P<O.05).由此可知,氟化物降低了甲状腺细胞TG,TPO,NIS基因表达水平,造成甲
状腺摄取和利用碘,甲状腺激素合成,贮存,分泌功能障碍,进而导致甲状腺结构和功能异常.
关键词:氟化物;FRTL细胞;甲状腺球蛋白;甲状腺过氧化物酶;钠碘转运体 中图分类号:$859.7文献标识码:A文章编号:1005—4545(2009)07—0885—04 Effectsoffluorideontheexpressionoffunctionalgenesrelatedwiththemetabo-
lismofthyroidhormoneinFRTLcells JIANGPeng,ZHANGWei—dong.,CHAIChun—yan,XIAORui,DINGMing—
xing.,LIUGuo—yan
(1.CollegeofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,Chi—
na;2.CollegeofAnimalMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;3.
CollegeofAnitaulMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China) Abstract:Toinvestigatetheeffectsoffluorideontheexpressionofthyroglobulin(TG),thyroidperoxidase
(TPO),odiumiodidesymporter(NIS)genesinFRTLcells,FRTLcellsculturedinvitroweretreatedinlogarithmic
phasewithsodiumfluorideatdifferentconcentrationof2O.0,l0.0,5.0,2.5,1.25mg/L,respectively.After72h,
thecellswerecollectedandsemi—
quantitativeRT-PCRforTGmRNA,TPOmRNAandNISITIRNAand8一aetin,=|,as
performed.Theresultsshowedthatcomparedwiththecontrolcells,theexpressionlevelsofTGgeneinFRTLceils
treatedwithlowerconcentrationofsodiumfluorideincreasedcompensatively,butdecreasedsignificantly(P<O.05)
withhigherconcentration(>5.0mg/L):theRT,
PCRproductsofTPoandNISinFRTLcellstreatedwithallcon—
centrationofsodiumfluoridereduced,someofthemweresignificant(P<O.O5).ItiSconcludedthatfluoridecanre—
ducetheexpressionofTG,TPO,NISgenesinthyroidcells,conseguentlycausedysfunctionofthyroidinuptaking
andunilizingofiodine,andsynthesizing,storing,secretingofthyroidhormones. Keywords:fluoride;FRTLcells;thyroglobulin(TG);thyroidperoxidase(TPO);sodiumiodidesymporter(NIS)
*Correspondingauthor
氟化物能导致动物甲状腺结构损伤,引起甲状
腺组织肿大以及合成和分泌甲状腺激素(TH)功能 障碍.目前,氟化物导致甲状腺损伤的复杂作用 机理还没有阐明.已知甲状腺球蛋白(TG),甲状腺 过氧化物酶(TPo),钠碘转运体(NIS)在甲状腺激 收稿日期:2008—04—06
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671544) 作者简介:江鹏(1983一),男,硕士.
*通讯作者
素的合成,分泌以及维持甲状腺正常结构过程中发 挥着重要作用[451.其中,TG是碘化酪氨酸和甲状 腺激素合成的载体,也是碘和甲状腺激素的贮存形 式L6;TPO是维持甲状腺功能正常的关键酶,促进 碘的活化,酪氨酸的碘化和偶联形成具有生物活性 的甲状腺激素;NIS介导和促进甲状腺细胞摄取 碘?8j.这些因子是合成和分泌甲状腺激素以及决定 甲状腺功能的关键蛋白,其编码基因表达正常与否, 直接影响到甲状腺结构和功能.本试验用氟化物处 理体外培养的大鼠甲状腺细胞系(Fisherratthy— 886中国兽医2009年7月第29卷第7期ChinJVetSciJu1.2009Vo1.29No.7
roidcellline,FRTL)细胞,观察氟化物对编码 FRFL细胞TG,TPO,NIS蛋白基因表达的影响, 从而在一定程度上为揭示氟引起甲状腺结构和功能 损伤的分子机理提供理论依据.
1材料与方法
1.1主要仪器和试剂3U1型CO细胞培养箱, 美国产;细胞超声破碎机,宁波新芝生物科技公司; 分光光度计,Eppendorf;MIAS一2000型凝胶成像分
, 析系统,'Vilber-Lourmat公司;PTC一200PCR仪Bio—Rad公司;RPMI一1640培养基和青链霉素,GIB—
CO公司;胎牛血清,Hyclone公司;L一谷氨酰胺,吉 诺生物医药技术有限公司;牛TSH,猪胰岛素,转铁 蛋白和氢化考的松,Sigma公司;氟化钠(分析纯,上 海凌峰);RT—PCR试剂盒,TaKaRa,Oligo(dT)18,
TaKaRa;PCR引物,上海生工生物工程技术服务公 司提供;DNAMarker,上海捷瑞生物有限公司提 供.
1.2FRTL细胞培养采用ATCC提供的FRTI 细胞(CRTL一1468)传代培养,完全培养基配方由 ATCC提供,RPMI一1640培养基,10的胎牛血清 (Hyclone),青链霉素在培养基中均为100U/mI, 牛TSH为0.01U/L,猪胰岛素为10mg/L.转铁蛋 白10mg/i,氢化考的松3.5mg/L,每100mL完 全培养基加1mLL一谷氨酰胺,在培养FRTL细胞 前1d制备完全培养基,完全培养基过滤分装,4? 备用;细胞置37?,59/6CO细胞培养箱培养,及时 观察细胞生长情况.
1.3氟化钠处理FRTL细胞和细胞的收集保存 细胞长满后(细胞存活率95以上),本试验在细胞 对数生长时加入不同水平的氟,细胞贴壁情况良好, 细胞存活率95以上,保证氟攻毒试验的正确性和 合理性.将细胞接种到6孔培养板中培养,接种数 目约1.0×10个/mL,定时观察细胞生长情况,当 细胞长至50,60时用氟化钠(Sodiumfluoride,
NaF)处理,使NaF在培养基中质量浓度分别为20, 1O,5,2.5,1.25mg/L,同时设空白对照细胞.72h 后收集FRTL细胞置无RNA酶EP管,一8O?冰 箱保存.
1.4FRTL细胞RNA提取和检测每管细胞(细
胞密度5.0×10个/mL)加1mL的Trizol试剂,反
复冻融,超声破碎5次,补加500LTrizol充分作
用细胞,提取细胞中的总RNA,8O的乙醇洗涤2
次,干燥后DEPC水稀释,分光光度计检测230,
260,280rim的D值,计算RNA的浓度,D26./D28. 和D../D?比值,RNA变性电泳检测RNA质量.
1.5合成cDNA和PCR反应以2g的总RNA
为
模板
个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载
,Oligo(dT)18作引物,使用AMV逆转录
体系25L,42?水浴60min合成cDNA; 酶,反应
PCR引物
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
参照文献[9—11],以cDNA为模板,
cDNA3.0tLL,10×buffer2.5uL,2.5U//xLTaq 酶1.0L,dNTP0.5L,MgC122.0tzL,TG,NIS, TPO基因和t?-actin上,下游引物均为1.0L,总反
应体系为25L.PCR反应条件为94C预变性5
min,94C45S,退火30S,72.C延伸30S,35个循环,
其中actin为40个循环,72?最后延伸10min.
表1TG,TPO,NIS,0actin的引物序列
引物
TG
TP0
NIS
引物序列塑垦堡壁!望壁兰!竺!::1
58057.02.0上游:5'-CAGCTATGGCAACAGAACT'I..3
下游:5'-GTGGCTCCAT1,CCCTCACT3 ,游:5GTCTGTCACGCTGGTTATGG-3 下游:5一CAATCACTCCGCTTGTTGGC,3
上游:5'-GGTGATCCTGGCCCGAGGCGTCA3 下游:5'-CCACTGTAAGCACAGGCCAGGAA一3
~t-actin上游:5一TGACGGG("TCACCCACACFGGc《I:Arcj'A3
下游:5'-CTAGAAGCAT'I,TGCGGTGGPCGI((;AGGG一3 1.6PCR产物电泳及光密度测定取1c"IPCR 产物进行1.0琼脂糖凝胶电泳.电泳结譬用紫:卧 透射仪观察并摄取图像,应用MIAS一2000固缘分析 系统进行光密度值测定.以每一样品的,IG,TP(), NIS基因光密度与其内参G—actin的光密}}蟑袭 示该样品PCR产物的相对含量.
17数据分析与处理应用SAS软件对所得数据
,数据以?5表 进行草图索方差分析进行t检验
示.
.
9结果
2.1FRTL细胞RNA提取结果提取的细胞 中国兽医2009年7月第29卷第7期ChinJVetSciJu1.2009Vo1.29No.7887
RNA用DEPC水稀释,检测到D../D..为1.7, 1.9,D.../D2.值为2.0以上.RNA变性电泳可见 明显的28S和18S条带,可见部分5S条带.检测 到RNA水平为0.5,0.85g/L,因而提取的总 RNA质量良好,可用于反转录合成cDNA. 2.2氟化钠处理的FRTL细胞功能基因表达结果 2.2.1氟化钠处理的FRTL细胞TG基因表达 由图1可知,随着氟化钠质量浓度的增加,FRTL细 胞TG基因表达量逐渐增加,当氟化钠质量浓度为 5.0mg/L时,FRTL细胞TG基因表达量最高;而 随着氟化钠的质量浓度进一步升高,TG基因表达 量则呈现逐渐降低的趋势.
bp
200
000
800
600
400
200
B-aetin
TG
图1不同水平氟化钠处理的FRTL细胞TG基因RT_PcR
产物电泳结果M.DNAMarker;1,6.分别为0, 1.25,2.5,5.0,10.0,20.0mg/L氟化钠处理72h的 FRTL细胞TG基因表达情况
2.2.2氟化钠处理的FRTL细胞TPo基因表达 由图2可知,随着氟化钠质量浓度的增加,FRTL 细胞TP0基因表达量逐渐降低.
2.2.3氟化钠处理的FRTL细胞NIS基因表达情 588
800
6OO
400
200
图2不同水平氟化钠处理的FRTL细胞TPO基因RT-
PCR产物电泳结果M.DNAMarker~1,6.分别为 0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0mg/L氟化钠处理72h 的FRTL细胞TG基因表达情况
bp
200
000
800
600
400
200
-~ttn
NlS
图3不同水平氟化钠处理的FRTL细胞NIS基因RT- PCR产物电泳结果M.DNAMarker~l,6.分别为 0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0mg/L氟化钠处理72h 的FRTL细胞TG基因表达情况
况由图3可知,氟化钠质量浓度为0,1.25,2.5, 5.0mg/L时,FRTL细胞NIS基因表达量相似,氟 化钠质量浓度为10.0,2O.0mg/L时,与对照(0 rag/L)细胞相比NIS基因表达量明显减少. 2.3氟化钠处理的FRTL细胞TG,TPO,NISRT- PCR产物电泳条带相对光密度值检测结果由表2 可知,氟化钠处理的FRTL细胞TG,TPO,NIS相 表2氟化钠处理的FRTL细胞TG,TPO,NISRT—PCR产物相对光密度值(士s)
注:*表示该浓度氟化物处理的细胞与对照细胞相比差异显着(P<0.05)
对光密度值的变化趋势与上述电泳图谱显示的结果 一
致.随着氟化钠质量浓度的增加,FRTL细胞
TG基因表达量表现为先显着增加而后显着降低的 趋势(P<O.05);而TPO基因表达量大体上随着氟 化钠质量浓度升高而不同程度降低(2.5mg/L及以 上质量浓度显着降低,P<0.05),呈现明显的剂 量,反应关系;较低质量浓度氟化钠处理的细胞 NIS基因表达量与对照细胞相似,高质量浓度时 (10.0,2O.0mg/L)时,NIS基因表达量则明显降低 (P<O.05).
3讨论
本试验选择进行体外培养FRTL细胞,研究氟 化物损伤甲状腺的机理.体外试验排除了下丘脑 腺垂体一甲状腺系统的调节作用,影响因素单一,更
能直接地揭示氟化物对甲状腺功能因子影响作用. 由试验结果可知,氟化钠处理的FRTL细胞 TG基因表达量在较低质量浓度的氟化钠作用下, 888中国兽医2009年7月第29卷第7期ChinJVetSciJul.2009Vo1.29No.7
呈现代偿性升高,随着氟化钠质量浓度的增加,这种 代偿作用丧失,TG基因表达量显着降低.这样就 有可能造成甲状腺功能蛋白TG量低于正常,使得 碘化酪氨酸和甲状腺激素合成的载体不足,碘以及 合成的甲状腺激素无法在甲状腺滤泡中正常贮存; 氟化物能够导致TPO活性下降已得到相关研究的 验证[1引.在本试验中,各个氟处理质量浓度的 FRTL细胞均表现为TPO,NIS基因表达量下降. TPO基因表达量下降造成的甲状腺功能关键酶 TPO合成不足以及活性下降,必然导致碘的有机 化,酪氨酸的碘化和偶联障碍;NIS是一种位于甲状 腺滤泡细胞膜上的糖蛋白,主要在甲状腺滤泡的基 底外侧膜进行表达.NIS作为"碘泵"是促进血液中 的碘逆浓度梯度向甲状腺中转运的关键因子,NIS 基因表达量下降必然导致碘的转运障碍和甲状腺细 胞摄碘率降低,从而不能合成足够的甲状腺激素. 总之,上述3种甲状腺功能蛋白在氟化物作用下基 因表达水平均呈下降趋势,直接造成甲状腺摄取和 利用碘,甲状腺激素合成,贮存,分泌功能损伤,并进 而导致甲状腺结构和功能异常.氟化物损伤甲状腺 的分子机理十分复杂,还需要进一步的体内,体外试 验来加以综合阐述.
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