铁超负荷对胰岛β细胞分泌胰岛素功能的影响

铁超负荷对胰岛β细胞分泌胰岛素功能的影响 铁超负荷对胰岛β细胞分泌胰岛素功能的 影响 四川医学2007年12月第28卷(第12期)SichuanMedicalJournal,2007.Vo1.28,No.12?1341- ?内科论着? 铁超负荷对胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响 冯婷,杨波,张祥迅,田浩明? (四川大学华西医院内分泌科,四川成都610041) 【摘要】目的建立胰岛细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面灌注系统,并检测次氮基三醋酸铁(FeNTA)溶液对正常大鼠离体胰岛细胞一相分 泌的影响. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 分离正常大鼠的胰岛细胞,将其分为3组:A组,B组和c组,每组合5O个胰岛,分别用不同的刺激液 进行灌注,检测40min内胰岛素的分泌量.其中,A组为对照组,灌注液为16.7mmol/L葡萄糖液;B组为舍铁的高糖液灌 注,包括B1组(高糖液舍有0.05mmol/LFeNTA)和B2组(高糖液舍有O.1mmo1/LFeNTA);C组为经过FeNTA孵育5h后用 高糖液灌注,包括c1组(孵育液中舍FeNTA0.05mmo1/L)和C2组(孵育液中舍FeNTA0.1mmo1/L);实验过程重复3次. 结果?正常大鼠的胰岛细胞在16.7mmol/L葡萄糖刺激下胰岛素分泌具有典型的早相分泌;?无论是在舍一定浓度的 (0.05mmol/L或O.1mmol/L)FeNTA的葡萄糖的刺激液灌注,还是经过舍FeNTA(0.05mmol/L或O.1mmo1/L)孵育液孵育5h 后再用高糖刺激液灌注,大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌均完全缺乏一相分泌,仅有不断出现的微小波动,分泌峰值仅仅较 基础状态略有增加.结论铁含量增加会损害胰岛细胞分泌胰岛素,这对阐明铁与糖尿病的关系具有一定的意义. 【关键词】胰岛细胞;铁;胰岛素;一相分泌 【中图分类号】R335.6【文献标识码】A【文章编号】1004.0501(2007)12.1341.03 TheEffectofIronOverloadonFunctionofPancreaticBCellsrealeaslnginsulin.FengTing,YangB0,ZhangXiangxun,et a1.DepartmentofEndocrinology,WestChinaHo~ital,S&hnanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China 【Abstract】 ObjectiveToinvestigatetheinsulinsecretionresponsivenessofisolatedratisletsinducedbyfluidstimulationin. eludingglucoseandiron.MethodsPancreaticisletswereisolatedfromnormalWistarrats.Theyweredividedintothreegroups,group A,groupBandgroupCrespectively.therewere50isletsineverygroup.Theywerestimulatedbydifferentfluid.GroupAisthecontrol. stlmulatedby16.7mMglucose;GroupBwasperfusedwith16.7mm01/LglucosefluidincludingFeNTA(GroupB1.includingFeNTA 0.05mmol/L;GroupB2,includingFeNTA0.1mmol/L).GroupCwasperfusedafterincubated5hourswithculturemediaincludingFeN. TA(GroupC1,includingFeNTA0.05mmo1/L;GroupC2,includingFeNTA0.1mmol/L);Wedetectedtheamountofinsulintllatislets secreted.Results? Therewastypicallyearlyinsulinsecretionresponsivenessinducedby16.7mmo1/Lglucosestimulationincontrol islets.? ItshowedcontinuousmicrofluctuationininsulinsecretionresponsivenessinducedbyglucosefluidincludingFeNTAandglucose stimulationaftertheculturemediaincludingFeNTAincubating,thepeakvaluewaslittlebiggerthantheamountofinsulininbasiccondi— tlon.ConclusionIftheamountofironincrease,thefunctionofpancreaticisletscellsreleasinginsulinwiHbedestroied,whichissignitl— cantfortheexplanationoftherelationbetweenironanddiabetes. 【Keywords】isolatedratislets;FeNTA;insulin;acuteinsulinreleasing 流行病学研究表明不论是1型糖尿病,2型糖尿 病还是妊娠糖尿病患者,都有部分患者存在铁代谢指 标异常,如血清铁,转铁蛋白饱和度,血清铁蛋白升高, 标志 禁止坐卧标志下载饮用水保护区标志下载桥隧标志图下载上坡路安全标志下载地理标志专用标志下载 着在这一人群中,铁储存增多普遍存在【ll2J,而 1865年发现的血色病相关糖尿病,其发病的直接原因 即铁代谢异常.也有研究表明血清铁浓度与胰岛素抵 抗和2型糖尿病的发生有一定的关系【,高铁含量可 以增加2型糖尿病的发生,可作为2型糖尿病的独立 危险因子【4J.但到目前为止,关于铁与胰岛I3细胞关 系的研究仍非常有限.本研究建立了胰岛细胞表面灌 注系统,检测次氮三乙酰铁(FeNTA)对正常大鼠离体 胰岛细胞一相分泌的影响,以求进一步阐明铁元素在 糖尿病发病中可能具有的作用. 1材料与方法 1.1试剂和仪器:硝酸铁(Fe(NO3).9H20)(天津化试 ?通讯作者 公司);二亚乙基三胺五乙胺(DETAPAC),次氮三乙酸 二钠(Na2NTA)和RPMI1640(购自美国Sigma公司);V 型胶原酶(购自华美生物技术公司);碳酸氢钠(NaH. c03)(上海化试公司);pH试纸(上海三爱思试剂有限 公司);无糖Hanks液(华西医科大学内分泌实验室自 行配制);蠕动泵(河北保定兰格恒流泵有限公司);超 净工作台(苏净集团安泰公司);CO培养箱(日本 SANYO电机株式会社);三用小水箱(江苏省金坛市荣 华仪器制造有限公司);SN.682放射免疫r计数器(上 海原子核研究所日环仪器厂);低温离心机(法国Jouan 公司);721分光光度仪(上海第三分析仪器厂). 1.2大鼠胰岛细胞的分离和纯化:取正常Wistar大 鼠,重约200—250g,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固 定大鼠,消毒腹部皮肤,开腹,辨认分离胰腺,将其置于 (含双抗青霉素lOOU/ml,链霉素100/.tg/rn1)无糖Hanks 液中漂洗3次,然后将胰腺置于含无糖Hanks液的5ml ? 1342?四川医学2007年l2月第28卷(第l2期)SichuanMedicalJournal,2007,Vo1.28, ?o.12 小烧杯中,用眼科剪刀剪成lmmXlmmx1mm大小,再 将其置于含有5ml(1.0mg/m1)V型胶原酶的培养瓶 中,于37?恒温水浴箱中边振荡边消化20,25min. 直至成小颗粒状时加入4?预冷的含10mmol/LHEPES 的无糖Hanks洗液稀释并终止消化.收集上层细胞悬 液,尚未消化的大块组织再转移至含有V型胶原酶的 培养瓶中继续消化20,25min,直至组织成细小沙粒状 时终止消化,将先后消化收集的组织用无糖Hanks液 清洗3遍,置于培养皿中,手工挑选大小相近的胰岛分 组备用J. I.3胰岛细胞表面灌注系统:胰岛细胞表面灌注系统 主要由蠕动泵,注射器,灌注仓,三用小水箱,软箱及三 通管等几部分构成.灌注仓为一圆柱形硬塑料管,上 粗下细,一硬管由上端盖中穿过探人灌注仓内,上端与 软管相连,下端出口处有孔径2Om的滤膜,可防止灌 注仓内细胞随液体流出,在出口软管的末端处收集软 管中流出的液体进行检测.灌注时细胞即加入灌注仓 内整个灌注仓浸泡在水浴中,温度保持37?恒温.灌 注仓人,出口外的软管均与蠕动泵相连,通过调节蠕动 泵的流速,使仓内的液体量保持一致,从而能够准确反 映仓内待测物质的浓度. I.4胰岛细胞灌注:每次取50个胰岛细胞团加入灌 注仓内,以含I.67mmol/L葡萄糖的基质液平衡60min, 每5min取流出液1次.随后各组以不同的高糖刺激 液进行灌注,分别为:A组灌注液为16.7mmol/L葡萄 糖液;B组为含铁的16.7mmol/L葡萄糖液灌注,包括 B1组(高糖液含有0.05mmol/LFeNTA)和B2组(高糖 液含有0.1mmol/LFeNTA);C组为经过含FeNTA孵育 液孵育5h后,再用16.7mmol/L葡萄糖液灌注,包括c1 组(孵育液中含FeNTA0.05retool/L)和c2组(孵育液 中含FeNTA0.1mmol/L).前lOmin每分钟收集流出液 1次,之后改为每3min收集1次至40min时结束.每 次收集时间为1min,蠕动泵转速为4.0r/min.灌注液 pH值为7.2;灌注仓置于37?恒温水浴中,测定流出 液中胰岛素浓度时重复2次,取2次测定值的平均值. 胰岛素浓度以mU/L/50islets表示,实验过程重复3 次. 1.5胰岛素的测定:按胰岛素放射免疫试剂盒(华西 糖尿病研究所) 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 操作. 1.6统计学方法:采用SPSS统计软件,重复测量资料 的方差分析,P<0.05表示有统计学意义. 2结果 2.1胰岛形态的鉴定:B细胞内锌离子含量较高,二 硫棕(DTZ)可与锌离子结合呈棕红色,能清楚显示胰 岛形态,可辨别胰岛.使用双硫棕室温染色10min后, 在解剖显微镜下观察呈棕红色团块状的即为胰岛.挑 选类似的细胞团即为胰岛. 2.2FeNTA对正常大鼠离体胰岛细胞一相分泌的影 响:正常大鼠的胰岛细胞分为A,B,c3组后,分别用 不同的高糖液刺激灌注,检测前10min每分钟流出液 的胰岛素浓度,及之后每3min流出液的胰岛素浓度, 胰岛素浓度以mU/L/50islets表示,结果见表1.其中, A组分别和B,c组进行统计学比较,结果P<0.O5,有 统计学意义;而B1,B2,C1组和C2组两两进行比较, 结果P>0.05,均无统计学意义. 表1各组不同时间胰岛素的分泌量(?s) 注:胰岛素浓度单位:mU/IM50islets;B,c组与A组比较,P均< 0.05 正常大鼠的胰岛细胞在16.7mmol/L葡萄糖刺激 下胰岛素分泌具有典型的早相分泌,在第1,2min内 迅速达到高峰,约为基础值的5一10倍,然后迅速下降 到达谷底,维持较为稳定的浓度,见图I. 0246810j622283440 时问(min) 图1正常大鼠胰岛细胞在高糖刺激下胰岛素的分泌 不论是在含16.7mmol/L葡萄糖的刺激液中包含 一 定浓度(0.05mmol/L,0.1mmol/L)的FeNTA,还是经 OOOO0OO?加 四川医学2007年12月第28卷(第12 期)SichuanMedicalJournal,2007,VOI.28.No.12?l343? 过含FeNTA(0.05mmol/L,0.1mmol/L)的培养液卵育5h 后高糖刺激液再灌注,同样的大鼠胰岛细胞的胰岛素 分泌截然不同,完全缺乏…相分泌,仅有不断出现的微 小波动,分泌峰值仅仅较基础状态略有增加,见图2, 图3. 昌 E 喜 富 墨 呈 日 鳘 024681O162228344O 时问(rain) 图2正常大鼠胰岛细胞在含FeNTA的高糖刺激下 胰岛素的分泌情况 O24681O162228344O 时间(rain) 图3正常大鼠胰岛细胞在含FeNTA的培养液中孵育5h后 高糖刺激下胰岛素的分泌情况 3讨论 一 相胰岛素分泌是指静脉输注葡萄糖使血糖升高 后,在血糖升高的l一3rain内开始的血中胰岛素水平 急速增加,其胰岛素来自储存在I3细胞内的分泌颗粒. 一 相分泌下降迅速,波形高尖,锐利,约于10rain之内 恢复至基线水平,又称急性胰岛素反应(AIR).在2型 糖尿病发生之前,胰岛素分泌的缺陷即已发生.有研 究表明:一相分泌受损可以预测糖尿病发生,一相分泌 越低,发生糖耐量受损或糖尿病的危险越大.因此,胰 岛素一相分泌功能对于糖代谢的影响至关重要. 在早期的实验研究中,Awai等J发现反复给动物 腹腔注射FeNTA造成铁超负荷,可使胰腺铁沉着,血 糖升高;还有研究发现,铁对细胞具有毒性作用的部分 原因是:?它介导的染色体突变事件累积引起了线粒 体功能障碍;?细胞浆中的铁触发了线粒体渗透性的 改变;?铁催化的氧化反应导致了溶酶体膜的不稳定. 其中产生的活性氧成分与铁剂对细胞产生协同的毒性 作用,还可使正常I3细胞溶酶体对氧化应激反应增 强. 胰岛细胞表面灌注法能够反映数分钟内胰岛细胞 分泌功能的动态变化,对研究胰岛素一相分泌具有其 它方法无可替代的优势,至今仍为国际上研究离体胰 岛功能的必选方法.我们在正常离体大鼠胰岛细胞体 外灌注实验发现,胰岛细胞经过含一定浓度 (0.05mmol/L,0.1mmol/L)的FeNTA的培养液孵育5h 后,使用含16.7mmol/L葡萄糖的刺激液灌注;或在含 16.7mmol/L葡萄糖的刺激液中包含一定浓度(0.05, 0.1mmol/L)的FeNTA直接进行灌注时,胰岛素分泌相 于单纯的高糖刺激对照组完全不同.与对照组相比, 一 相分泌峰值几乎完全消失,这说明铁对胰岛细胞分 泌功能的损害非常迅速,明显.最近又有一项研究表 明l_8J:转铁蛋白和铁蛋白与糖代谢异常的出现均呈正 相关,进一步支持了铁代谢有可能引起胰岛素抵抗和 2型糖尿病的发生的假说.本研究通过胰岛细胞表面 灌注法说明了一定浓度的铁负荷会使正常离体胰岛细 胞的一相分泌消失,严重影响j3细胞的正常分泌功能. 这可能对阐明铁与糖尿病的关系具有积极意义.综上 所述,铁超负荷可能通过损害胰岛素一相分泌,导致糖 耐量的异常. 参考文献: [1]RenY,TianH,LiX,eta1.Elevatedserumferritinconcentrationsinglu— cose-impatiredpopulationandinnormalglucosetolerantfirst-degreerela- tivesinfamilialtype2diabeticpedigrees[J].DiabetesCare,2004,27(2): 622,623 [2]Lao'IT,ChanLY,TamKF,eta1.Maternalhem0globinandriskofgesta- tionaldiabetesmellitusinChinesewomen[J].ObstetGynecol,2002,99 (5Pt1):807,812 [3]JehnM,ClarkJM,GuallarE,eta1.Serumferritinandrisk0fthemetab0lic syndromeinU.S.adults[J].DiabetesCare,2004,27(10):2422,2428 [4jJiangR,MansonJE,MeigsJB,eta1.Bodyironstoresinrelationtoriskof type2diabetesinapparentlyhealthywomen[J].JAMA,2004,291(6): 7ll,7l7 [5]李永翔,李戈,董维平,等.大鼠胰岛分离纯化技术的改进[J].复旦 (医学版),2006,33(2):266,268 [6]HeikkilaRE,CabbatFS.Thepreventionofalloxan.induceddiabetesin micebytheiron-chelatordetapac:suggestionofaroleforironinthecyto? toxicprocess[J].Experientia,1982,38(3):378,379 [7]EatonJW,QianM.Molecularbasesofcellularirontoxicity[J].FreeRadic BiolMed,2002,32(9):833,840 【8]FredericF,FranckP,FattiD,eta1.Ferritinandtransferringarebothpre- dictiveofthehyperglycemiainmenandwomenover3yearsthedatafrom anepidemiologicalstudyontheinsulinresistancesyndrome(DESIR)study [J].DiabetesCare,2006,29(9):2090,2094 (收稿日期:2007.07.24) ??加佰加0???{寻佰加0