[doc] 两种方法分离人抗肾小球基底膜抗体靶抗原

[doc] 两种方法分离人抗肾小球基底膜抗体靶抗原 两种方法分离人抗肾小球基底膜抗体靶抗 原 第18卷第1期 2005 汕头大学医学院 JournalofShanhmUniversityMedical ?.18No.1 2?5 两种方法分离人抗肾小球基底膜抗体靶抗原 辛岗”,赵明辉 (1汕头大学医学院微生物学与免疫学教研室,广东汕头515041;2北京大学第一医院肾内科,北京100034) [摘要]目的:比较超声粉碎法和化学去污剂法对人抗肾小球基底膜(GBM)抗体靶抗原(粗抗原)的分离纯化效果.方法: 取正常肾组织分离肾小球,用两种方法分别分离GBM,将胶原酶消化后的可溶性蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并用 Westernblot和JSA法检测抗GBM抗体与所分离靶抗原的反应情况.结果:电泳结果显示两种方法分离纯化的可溶性蛋白 相对分子质量都主要位于27ku和54ku,且均为抗GBM抗体阳性血清所识别.ELISA显示两种方法分离纯化的蛋白与抗 GBM抗体相关疾病患者的血清均呈阳性反应.结论:两种方法都可 以用于抗GBM抗体靶抗原的分离纯化,且化学去污剂 方法更为简便. [关键词]肾小球基底膜;抗体;靶抗原 [中图分类号]R392.33[文献标识码]A[文章编 号]1007-4716(2005)01.0012.03 TwoMethodstoIsolateTargetAntigenofHumanAnti—glomerular BasementMembraneAntibody XINGang,ZHAOMing-hui2 (1DofMicrobiologyandImnumology,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,Chkta; 2拥删 ofNephrology,PekingU,’,ive~yFirstHospital,&100034,Ch/na) [Abstract]Objective:Toioslatetargetantigenofhumananti—glomerularbas ementmembraxle(GBM)antibodyusing twomethodsofultrasonicdeviceanddeoxycholicacidextractiontechniquerespectively.Methods:GBMwereisolatedby ultrasonicdevicetechniqueanddeoxychdicacidextractiontechnique.ThenGBMwasdigestedbycoBagenase.Andthe solubleproteinsofGBMwereassessedbySDS—polyacrylamidegelelectro phoresis(PAGE)andWesternblotanalysis.The ELISAWasusedtodetecttheanti.GBMantibody.Results:SDS.PAGEshowe dthesolLd)leproteinswere27kuand54 ku,andcouldbeblottedbyanti.GBMantibodies.ThepurifiedsolLd)leprotei nscouldreactwiththeantiGBMantibody inELISA.Conclusion:ThetwomethodsCanbeusedtoisolatetargetantigeno fhumananti—GBMantibody,andthe deoxycholicacidextractiontechniqueissimpler. [KeyWords]glomerularbasementmembrane;antibody;targetantigen 抗肾小球基底膜(glomerularbasementmembrane, GBM)抗体相关疾病是一组自身免疫病,其共同特 征是血清中存在抗GBM抗体并在脏器沉积…,因 此早期检测抗GBM抗体对本病的诊疗至关重要J. 目前对抗GBM抗体的检测多采用胶原酶消化后的 GBM可溶性蛋白(粗抗原)作为固相抗原的ELISA 法.国外研究对抗GBM靶抗原(粗抗原)的分离 纯化多采用物理(超声粉碎)方法.本研究采用化学 去污剂法和超声粉碎法对抗GBM抗体进行分离纯 化,并对两种方法分离效果进行对比,以研究化学 去污剂方法的可行性. 织的正常部分,随即置于冰壶中,并冻存于.2o? 冰箱.抗GBM抗体阳性血清取自北京大学第一医 院肾脏内科患者. 1.2分离纯化抗GBM抗体靶抗原 1.2.1超声粉碎法冻存的肾脏组织于4cI=冰 箱解冻后,剥离肾脏脂肪组织及被膜,将’肾皮质切 成1n1?l3的小块,用瓶底挤压通过孔径105tan的 筛网,同时用PBS(0.01mol/L,pH7.4,含O.2L 叠氮钠)冲洗.再通过孑L径125/an的筛网后,最终 在筛网(孔径65tan)上收集’肾小球,显微镜下观察 肾小管计数小于5%.将分离出的肾小球悬浮于 l材料与方法—— 收稿日期:2004—12—10 1.1材料作者简介:辛岗(1973一),女,山西太原人,硕士,讲师. ‘肾脏组织标本取自’肾脏肿瘤切除后远离肿瘤组主要从事蛋白纯化, 自身免疫病等研究. ? 1’? 两 lmol/LNaC1溶液中,置冰浴后进行超声(强度I8 )粉碎.每次约20s.间厢1O,共l0次.再以 1700dmin.4.c离心15min,弃上清,沉淀物即为 GBM.GBM进一步进行胶原酶消化:按1g沉淀物 加人2I胶原酶的比例,将沉淀物溶解在胶原酶 消化缓冲液(5Omr~l/LHEPES,10mmol/LCaCl)中, 37慢速磁力搅拌20h后,10000r/min离心30 min.弃沉淀,上清即为胶原酶消化后的可溶性 cBM粗抗原. 1.2.2化学去污荆法将分离出的肾小球1:1(30 (体积比)加 H7.4,50mmol/L的Tris-HC1缓冲液 [含蛋白酶抑制剂(5n’~ol/L盐酸苯甲脒,25mmo1]L 6毒c基己酸,4nmaol/LNEM,lmmol/LPMSF,10 rmnob’LE町A)及O.2g/L叠氮钠]中,4?慢速磁力 搅拌1h,2500r/rain离心10min后,按l:15(体积 比)将沉淀物与40L去氧胆酸钠溶液(含蛋白酶抑 制剂及0.2L叠氮钠)混合,372.5h后3500r, Inin离心10rain,沉淀物用洗涤液(pH7.4)(5O mmol/LTris-HC1缓冲液,蛋白酶抑制剂,0.2gfL叠 氮钠)洗3遍.再按1:5(体积比)将沉淀物与DNA 酶I液[DNA酶I50Kunitzu/mL于50mnM/LTris.HC1 含10mnml/LMgck.5mg/LBSA,0.2g/L叠氮钠] 混匀,37?lh后,3500r/rain离心10min.沉淀物 再用洗涤液洗3遍.沉淀物即为GBM.将GBM再 进行胶原酶消化,在胶原酶消化缓冲液中加入蛋白 酶抑制剂(50mmol/LHEPES,蛋白酶抑制剂,10 nanol/Lc.c12),消化过程同超声粉碎法. 1.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及Western blot 聚丙烯酰胺凝胶浓度12.5%.非还原型,上 样量约l0.稳定电流约25mA,电泳时间1.5h, 考马斯亮蓝染色,脱色后扫描记录结果.靶抗原电.550型酶标仪 (B[O.RAD公司,美国)490nnl 读取光密度(oD)值,比较阴,阳性血清显色情况. 2结果 2.1两种方法分离纯化GBM可溶性蛋白SDS- P3.GE结果(图1) 两种方法分离的蛋白条带基本一致.靶蛋白分 子质量主要位于27ku和54ku左右,符合文献报 道的靶抗原?型胶原链非胶原区l[n(IV)NC1]的单 体和双体位置’.Westernblot结果显示抗GBM抗 体识别两种方法分离的靶抗原的位置一致,也均为 27ku和54ku(图2). 图2Westernhim结果 Fig.2Westernblotanalysis 1,3,5抗碌为坦声粉碎洼分离的靶抗原 2.4,6抗原为化学去钙剂挂抒离的靶抗原 1.2空白对脓3,4阴性对照血清 56抗GBN抗体阳性血清 2.2EUsA结果 采用超声粉碎法分离纯化的靶抗原的ELISA结 果:空白对照OD值0.0O2,阴性对照0.012.阳性 对照1.528采用化学去污剂法:空白对照OD值 0.002.阴性对照0.008,阳性对照1.712.两种方 法空白对照及阴性对照均未显色.阳性对照显色明 ? 13? 第1期辛岗等.两种方法分离人抗肾小球基底膜抗体靶抗原 显,且与阴性对照OD值均相差1.5以上,说明两 种方法分离纯化的可溶性抗原均可以为抗GBM抗 体血清识别. 3讨论 抗GBM抗体相关疾病的临床表现为急进性肾 小球肾炎和(或)肺出血,其共同特点是循环中有抗 GBM抗体存在,肾脏可见抗GBM抗体沉积.GBM 主要由?型胶原组成,每个?型胶原分子由3条 a链组成[a(IV)链].而抗GBM抗体的靶抗原主要 位于GBM的?型胶原a链的非胶原区1[a(IV) NC1],且主要位于链l6】,余a链及胶原的其他 部分或GBM中的其他蛋白也可作为其靶抗原J. 因此抗GBlVl抗体靶抗原的分离纯化即首先分离纯 化肾小球的基底膜胶原酶消化的可溶性蛋白,进一 步还可继续纯化a(IV)NC1. 抗GBM抗体的及时检测对于抗GBM抗体相关 疾病的早期诊断和治疗非常重要.既往采用患者肾 活检标本和正常人新鲜冷冻肾组织为底物的免疫荧 光法,对肾组织的要求较高,判断结果较为主观, 敏感性也较低.采用人GBM可溶性蛋白为抗原的 ELISA法则大大提高了检测的敏感性和特异性J. 本文首次同时应用传统的超声粉碎法和改良的化学 去污剂法分离纯化人GBM可溶性蛋白,并对两种 方法进行比较.采用超声粉碎法时,首先必须具备 超声粉碎仪;另外,超声的强度与分离的效果有很 大关系,强度太大会造成GBM过于粉碎,而超声 强度不够又不能粉碎肾小球;离心速度也较难掌 握,要使打碎的GBM沉淀而其他物质悬浮.这些 原因使采用超声粉碎法分离抗GBM抗体粗抗原较 难.本研究发现采用去氧胆酸钠抽提破坏肾小球内 细胞,同时使用DNA酶I去除细胞核DNA,且在 缓冲体系中始终使用蛋白酶抑制剂防止蛋白成分在 提纯过程中被降解,不需特殊仪器且实验过程较简 单,同样可以达到传统超声粉碎方法的分离效果. 本研究结果显示两种方法都可以分离纯化人GBM 可溶性蛋白,且都可以用于检测抗GBM抗体,化 学去污剂方法更为简便易行.但要指出的是两种方 法所分离出的粗抗原除了主要的2个条带外还有其 它的蛋白成分,仍可进一步纯化.而本研究也为进 一 步的研究提供了实验基础. [本研究是在北京大学第一医院工作期间完成] 参考文献: [1]ShahMK,Hughir~SY.Characteristicsandoutcomesofpa. tientswithGoodpasture’ssyndrome[J].SouthMedJ,2O02, 95(12):1411—1418. [2]赵明辉,丁焦生,刘玉春,等.41例抗肾小球基底膜 抗体相关疾病的临床和病理分析[J].中华内科杂志, 2001,40(5):316—320. [3]JaskowskiTD,MartinsTB,LitwinCM.eta1.Comparison offoureilzy//~inununoassaysforthedetectionofimmunoglobu. 1inGanagainstglomerularbasementmembrm~e[J].J ChnLabAnal,2O02,16(3):143—145. 14]HeUmarkT,JohanssonC,WieslanderJ.Characterizationof anti-GBMantibodiesinvolvedinGoodpasture’ssyndrome[J]. KidneyInternational,1994,46:823—829. 15]ShaneSA,YongkiK,E伍eCT.Effectsofmatrixglycatiou Oilmesar~alcelladhesion,spreadingandproliferation[J]. KidneyInternational,1994,46:1359—1367. [6]HeUmarkT,BrunmarkC,TrojnarJ.eta1.Epitopemap. pingofanti-glomenaarbasementmembrane(GBM)antibodies withsyntheticpeptid,~[J].ClinExpIrnmunol,1996,105: 504—510. [7]HudsonBG,TryggvasonK,SundaramoorthyM,eta1. 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