几种芽胞杆菌溶血素BL基因及其溶血素的检测

几种芽胞杆菌溶血素BL基因及其溶血素的检测 几种芽胞杆菌溶血素BL基因及其溶血素的 检测 微生物学杂志2007年5月第27卷3期 JOURNALOFMICROBIOLOGYMay2007Vo1.27No.321 几种芽胞杆菌溶血素BL基因及其溶血素的检测 王利国,王琦,齐俊生,付学池,梅汝鸿 (中国农业大学农学与生物技术学院,北京100094) 摘要用PCR 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 对几种芽胞杆菌溶血素BL基因进行了检测,结果表明7株蜡样 芽胞杆菌含有溶血素 BL基因hblA,hblC,hblD,其他枯草芽胞杆菌,多粘类芽胞杆菌,地衣芽胞杆菌检测 到部分溶血素基因;通过血 平板培养的方法检测结果表明只有含有溶血素全部基因的菌株才会产生溶血环, 从而为筛选不产生溶血素的 有益芽胞杆菌奠定一定基础. 关键词芽胞杆菌;基因;溶血素;PCR;血平板 中图分类号Q93—31文献标识码A文章编号1oo5—7021(2007)03—0021—03 DetectionofHemolysinBLGenesandHemolysininSeveralBacillusSpecies WANGLi-guo,WANGQi,QIJun—sheng,FUXue-chi,Meinl-hong (Col1.ofAgronomy&Biotech.ChinaAgricUniv.Beijing100094) AbstractHemolysinBLgenesweredetectedfromseveralBacillusspeciesusingPCRmethod.Theresultsshowed thatsevenBacilluscereuscontainedhblA,hblC,andhblD,partialhemolysinBLgeneswereal sodetectedfromB. subtilis,B.1icheniformis,andB.polymyxa.Theresultsofdetectionthroughcultivationonbl oodagarplatesuggested thatonlythosestrainscontainingcompletehemolysinBLgenescouldproducehemolysisrin g,itthuslaidacertain foundationforscreeningbeneficialandhemolysin—nonproductiveBacillusstrains KeywordsBacillus;gene;hemolysin;PCR;bloodagarplate 从植物体内分离得到的有益芽胞杆菌(Bacil- lus)由于存活期较长,且具有促进植物生长,防治 多种病害的功效等特点,被普遍认为是一种很好 的生防菌,有些芽胞杆菌制剂已商品化.但是,由 于有些芽胞杆菌被认为是人类的一种条件致病 菌,对人类健康的主要威胁是造成食物中毒,其毒 性主要由具有溶血活性的溶血素BL所引起…, 溶血素BL由一个结合亚基B(37.5ku),两个溶 血亚基L1(38.2ku),L2(43.5ku)组成,本研 究的目的在于对几种芽胞杆菌溶血素BL基因及 其溶血活性的检测,为筛选不产生溶血素的生防 菌具有重要意义,确保其在农业生产中的安全性. 现将研究结果报道如下. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1供试菌株供试菌株来源与特性见表1. 表1供试菌株 Table1Testingstrains 收稿日期:2006—11—20 作者简介:王利国男,硕士.现从事植物病害生物防治与工程菌株构建. 基金项目:国家自然科学基金项目(30640044) 通讯作者 微生物学杂志 1.1.2引物根据不同细菌溶血素BL氨基酸 保守区域(HYGKHH和DVWEHAYY) 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 hbIA, hbIC,hbID引物(表2),引物由北京赛百盛基因技 术有限公司合成. 1.1.3试剂TaqDNA聚合酶等PCR相关试剂 为大连宝生物产品,PCR产物回收试剂盒购白天 根有限公司,其他试剂均为分析纯. 1.2方法 1.2.1菌株培养菌株在LB平板和液体培养 基中28?培养. 1.2.2芽胞杆菌溶血素BL基因的检测细菌 总DNA的制备等操作见参考文献[3],以基因组 DNA为模板PCR扩增hbIA,hbIC,hbID部分序 列.PCR扩增条件(表2),将PCR产物用1%琼 脂糖凝胶电泳,EB染色后经TANON凝胶成像系 统成像. 1.2.3芽胞杆菌溶血活性的检测?血平板的 制备:在普通营养琼脂培养基础上121oC灭菌 15rain,冷却至50?后加入5%,10%无菌脱纤 维羊血混匀,倒人培养皿中4oC保存备用;?溶 血活性的检测:将制备好的血平板置于室温1d 以上,将活化的菌株接种于血平板中2824h 后观察. 表2PCR引物与扩增条件 Table2PCRPrimersandcondition 2结果 2.1芽胞杆菌溶血素BL基因的检测 根据已设计的引物扩增结果为:地衣芽胞杆 菌W一2只检测到hblC基因,蜡样芽胞杆菌910,多 粘芽胞杆菌m一1,枯草芽胞杆菌w一3,908只检测 ,蜡样芽胞杆菌901,902, 到hbID与hblC基因 903,904,905,906,907,836全部检测到溶血素 BLhbIA,hbIC,hbID基因(表1),表明大部分蜡样 芽胞杆菌含有溶血素BL基因(图1). 图1PCR扩增结果 Fig.1PCRamplificationpatternsofBacillus A:hblA;B:hblD:C:hblC 3期王利国等:几种芽胞杆菌溶血素BL基因及其溶血素的检测232.2芽胞杆菌溶血索的检测 芽胞杆菌在血平板上的溶血结果为蜡样芽胞 杆菌901,902,903,904,905,906,907,836在血平 板上28?培养24h后出现溶血环,其他芽胞杆 菌均未出现溶血环(表3,图2). 表3Bacillussp.中溶血素BL基因 及其溶血环的检测结果 Table3DetectionofhemolysinBLgenesand hemolysininBacillusspecies 基因及产生溶血环.因此在生产和应用中应选用 不含溶血素素基因或产溶血素量低的菌株,或通 过现代分子生物学技术剔除菌株中的溶血素基 因,构建新型安全的工程菌株,是降低风险的有效 方法.因此,采用PCR技术及血平板培养方法快 速检测菌株的溶血素基因及其溶血性具有重要 意义. 图2芽胞杆菌溶血素BL溶血环及其基因检测结果 Fig.2ThehemolyticpatternsanditsgenesofBacillusstrains 3讨论参考文献: 芽胞杆菌作为生防菌株在实际中已大量应 [1]Handelsman,eta1.ENTEROTOXIN.DEFICIENTBACILLUS 用,但由于有些芽胞杆菌被认为是人类的一种条 [P],UnitedSlatesPatenl,USA,602,712B2,5,2003, 件致病菌,同时菌株的安全性问题正逐渐受到重[]B...D'JandM.i"?DA….i...p...y' 视.本实验结果表明只有当溶血素所包含的三个:i:Bac"..?hhn99.':m 亚基的基因同时存在时才会表现出溶血环,与[3]sb.kJ, FritsehEF,ManiatisT.Mol..1c1.ig:A Beecher,D.J.,andWong等人研究结果一致.同 Lab0at0ryManua1[M].2nded.NewY0rk,ColdSp"gHar^ 时表明绝大部分蜡样芽胞杆菌含有溶血素的全部borLaboratoryPress,1989? 四阿阗雹鳍国学圆寇))