乳酸乳球菌l0230分支氨基酸转移酶的基因克隆_图文
乳酸乳球菌L0230分支氨基酸转移酶
的基因克隆,测序及失活
美国2000年威斯康星麦迪逊大学
应用与环境微生物学
通过互补的大肠杆菌DL39，在9kb的染色体插入片段上鉴定出了乳酸乳球菌LM0230的分支氨基酸转移酶基因(ilvE)。一个2kp大小的片段的测序结果表明，一个1023bp的开放读码框能编码一个340个氨基酸组成的蛋白质。此推论出的氨基酸序列的测序分析显示出于嗜血球菌的ilvE有62%的同源性，并且与GenBank中分类为第五类氨基酸转移酶的来自多种生物体的ilvE有较高的相似性。在复合培养基中对数生长期之后，ilvE作为一个1.1kb的转录物转录为单顺反子。疏水性图分析和一条肽链序列缺失显示ilvE是一种细胞溶质蛋白。 通过基因替换，缺乏IlvE活性的LM0230被构建成了一种派生物。在缺乏氨基酸但是含有α-酮酸生物合成前体物质的限制性培养基中，比较ilvE缺失菌株与野生型菌株的生长能力，发现IlvE是唯一能够利用生物合成前提物质合成异亮氨酸和缬氨酸的酶。比较IlvE突变体与LM0230的氨基酸转移酶活性，结果表明突变体中的异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸，蛋氨酸和苯丙氨酸的酶活性分别低2,4.5,43,40,76%。牛乳中为观测到突变体和LM0230生长与腐败率的不同。
乳酸菌(LAB)被广泛用于发酵乳制品，因其能通过发酵乳糖产生乳酸来降低乳的pH值，产生各种酶类及代谢产物促进质构和风味的形成。与乳酸菌能够在牛乳中生长并进而降低pH值的相关的乳酸菌的生理特性已经被系统而详细的研究了，但能够影响产品质构和风味的特性却关注的较少。例如，在研究LAB的蛋白质水解体系和这些体系为LAB在乳中生长提供重要的氨基酸的研究取得了重大的进展。然而，我们的研究是目这些酪蛋白的水解产物，氨基酸，是如何被机体代谢，并沌河成干酪风味物质的，目前这些研究的较少。
一些能启动氨基酸代谢的酶类已经被报道过了。包括氨基酸转移酶，脱氨酶，脱羧酶以及裂合酶。氨基酸转移酶催化α氨基可逆的一种转换，对许多氨基酸的合成和代谢是至关重要的。在原核生物和真核生物中通常有三种氨基酸转移酶，分别是酸性氨基酸转移酶，芳香族氨基酸转移酶和分支氨基酸转移酶。这三种酶均需要磷酸吡哆醛作为辅酶。分离自乳中的乳酸乳球菌是许多氨基酸的营养缺陷型菌，这很可能是由于适应牛乳这样的营养丰富的环境下选择压力所引起的。因为数众多的乳酸乳球菌是Leu,Ile,Val这样编码IlvE酶活性的营养缺陷的，因此在支链氨基酸(BCAAs)的代谢中可能涉及到这一酶。细菌利用氨基酸转移酶在BCAAs和BCAA转移产物上的活性来产生代谢能量，碳源，调节NADH/NAD+的比率，从α-酮戊二酸回收Glu，产生铁载体，合成泛酸，并为细胞膜的合成产生支链脂肪酸。乳酸乳球菌产生的IlvE的同系物是否具有相似的生物学功能尚无定论。
有证据表明，由蛋白酶水解酪蛋白产生的氨基酸转化成乙醛，醇类，脂肪酸，酯类和硫醇。而且，许多氨基酸也作为对干酪风味形成有重要影响的产生挥发性组分的前体物质。其中以些挥发性组分，例如3-甲基丁醛，2-甲基丙醛，异丁酸和异戊酸，在结构上与BCCA类似，有可能来自于BCCA的分解。最近发表的综述充分的讨论了由乳酸菌引起的BCCA的水解和这对干酪风味形成的影响。
已经证明氨基酸转移酶可以再类似干酪的条件下引发芳香类氨基酸和甲硫氨酸的水解。这些研究支持这一假说，即氨基酸转移酶依法途径在Cheddar干酪中存在的挥发性组分的产生中被涉及到。给出了氨基酸转移酶在干酪后熟过程中针对挥发性风味组分形成的潜在的作用，乳酸乳球菌的氨基酸转移酶催化途径的特性引起了我们进一步的研究兴趣。本研究集中于乳酸乳球菌的ilvE基因的分子特性，以及此基因失活菌株的特性。
材料和
方法
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菌种，质粒和培养基。研究所用的菌种和质粒在表1中列出。所有的菌种均在6.9%的脱脂乳和10%的甘油中，-80?保存。大肠杆菌在LB肉汤培养基中37?通风常规培养。如无特殊说明，含有20种常见氨基酸的M9培养基均按50μg/ml配置。此外，每ml的M9
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培养基中含有20μg的腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶和黄嘌呤。如无特殊说明,L.lactisLM0230及诱导物在还有0.5%的葡萄糖(M17-G)或乳糖(M17-L)M17培养基,30?常规培养。乳酸菌限制培养基(DM)根据Jensen和Hammer所报道的方法配置，使用Jenness 和Koops 报道的盐溶液。
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