感受态细胞的制备

　方法一 A液：1M，MnCl2： B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌； C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。 取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。     划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时， 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ul DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。 效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。     洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。     预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。     关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。     现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。     根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。 　1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。 2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。 3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。 4、培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。 5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。 6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。 7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。 8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。   方法二 1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落. 2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率. 3.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度. 4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟 5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体 6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟 7.再次离心回收菌体 8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟 9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上. 10.在液氮或-80度保存. 方法三 （1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。 （2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。 （3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 （4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 （5）重复第4步操作。 （6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。 （7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。 本法效率极高,建议大家采纳 【yog】 1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5) 2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min 3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min 1．感受态的制备 （1）接种单菌落于2ml LB培养液中，37℃过夜。 （2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。 （3）倒入1.5mlEP管内1ml菌液，冰浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。 （4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl2500ul悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。 （5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl20.1ml轻轻混匀，冰浴1～2h。 建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。 以下为转贴，具体方法请最好查阅文献。 TSS方法制备感受态细菌（又称一步法） 一、准备工作 1、 缓冲液1×TSS的配制：事先配制1M的氯化镁——20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装,不用灭菌。取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯,用量筒量取100ml去离子水,加入至烧杯中,取 1 g 蛋白胨,0.5g酵母抽提物,0.5g氯化钠,10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO,5ml 的1 M氯化镁,溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5,混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度,保质期约6个月。 2、已划平板(或者用枪头沾取并稀释后涂布)并在培养箱中过夜培养的菌种——Dh5α,用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶,分别装有30 ml和50mlLB,灭菌后置于4℃冰箱备用。3、 若干已灭菌的琼脂平板,一个未加抗生素,用于第二步的接种。其余做转化用。 二、 感受态制备程序： 1、前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养(12-16h),按1：100 比例将过夜培养的菌液(500ul)加入到新鲜的50 ml LB培养液中,于37 ℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40～50min)。 2、冰浴30分钟后4度1000g离心10min,弃上清,收获细菌。加入原体积十分之一(这里为5 ml)的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞,然后分装成100 ul/份,全部冰上操作,-80度保存。 三、 转化时取一管(100 ul)感受态细菌,(冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用)加入3-5ul DNA(0.1～100ng),轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液,37度150r/min温和振荡培养60min,涂布,室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养(17-20h)。 E.coli感受态细胞制备方法: 单菌落平板至2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至OD600 =0.2-0.4 离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作. 转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42℃ 90秒，冰上2分钟，加LB至1ml , 37℃ 1小时后铺抗生素平板。 TSS: 7.0ml pH6.1 LB 2.0ml 50% PEG6000 0.5ML DMSO 0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4) 0.3ml ddH2O 大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化 1．感受态的制备 （1）接种单菌落于2ml LB培养液中，37℃过夜。 （2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。 （3）倒入50ml管内，冰浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。 （4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。 （5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。 2．重组DNA的转化 （1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记： （2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。 （3）42℃90s。 （4）37℃水浴5min。 （5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。 （6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。