致突变作用及其试验方法与评价

特殊毒性试验及其评价第一节致突变作用及其试验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 与评价第二节生殖发育毒性作用及其试验与评价第三节致癌作用及其试验方法与评价第一节致突变作用及其试验与评价方法一、基本概念二、突变类型三、突变的发生与修复机制四、致突变试验与致突变作用评价1．DNA与基因DNA由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构。遗传学基础基因（gene）：DNA分子中最小的完整功能单位，是生物遗传信息的携带者基因组（genome）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质2、染色质与染色体在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质。它由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。*Nucleosome核粒chromatin染色质在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体，故染色质与染色体是由相同物质组成的；染色体存在于细胞中，通常只有在细胞分裂时经过特殊染色才能清楚地看到。2009-6-30染色体与基因有着平行的关系①染色体可以在显微镜下看到。②染色体成对存在，基因也成对存在。③个体中成对的基因一个来自母本，另一个来自父本。④不同对基因形成配子时的分离与不同对染色体在减数分裂期的分离，都是独立分配的。3、基因型与表型基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。 G0：DNA合成前期； G1：DNA合成期； S：完成DNA复制； G2：为有丝分裂做准备； M：有丝分裂期4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂有丝分裂过程有丝分裂指细胞核分裂的过程，一个细胞由此生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体。减数分裂过程生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续，这个过程称为遗传。遗传的稳定是相对的。在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变异。一、基本概念造成生物变异的原因有：①亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生；②由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源；③由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。自发突变(spontaneousmutation)是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。特点：自发突变的发生过程长，频率极低,与物种的进化有关。诱发突变(inducedmutation)是指人为的造成突变。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生新的表型效应称为突变。突变的分类 基因突变(genemutation)：一个或几个DNA碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。 染色体畸变(chromosomeaberration)：染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。 染色体结构改变 染色体数目改变二、突变类型遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤：基因突变染色体畸变基因突变一个或几个DNA碱基对的改变。染色体畸变染色体的结构及数目改变。端粒姊妹染色单体着丝粒组蛋白双螺旋碱基对端粒这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损所致。基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的，其区别在于受损程度。通常以光学显微镜的分辨率0.2µm来区分基因突变和染色体畸变。基因突变是用光学显微镜观察不到的，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变可用光学显微镜进行观察。1.基因突变基因突变指基因中DNA序列的变化。因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。①碱基置换指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。②移码突变移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。③整码突变指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。④片断突变指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。2.染色体畸变指染色体的结构异常和数目异常，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。（1）染色体结构异常有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，可在机体或细胞群传递。容易观察到的畸变有染色单体断裂、染色体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、双中心粒染色体、环状染色体及某些相互易位。染色体结构变异类型染色体缺失,如果蝇的缺刻翅染色体重复,如果蝇的棒状眼染色体倒位染色体易位,如夜来香的变异在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。指染色体上狭窄的非染色带，无线状连接者为断裂。带宽超过染色单体宽度。①裂隙（gap）和断裂（break）一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。②无着丝粒断片（fragment）、缺失（deletion）染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。③环状染色体（ringchromosome）当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180再重接，称为倒位。④倒位（inversion）当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。如果此时有缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。⑤插入（insertion）和重复（duplication）两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。⑥易位（translocation）（2）染色体数目异常整倍性畸变：单、三、四、多倍体非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少多条2n-1,2n-2,…2n+1,2n+2,…*染色体数目异常的基本类型注：A、B、C、D代表非同源染色体 类型 公式 染色体组 整倍体 单倍体 n (ABCD) 二倍体 2n (ABCD)(ABCD) 三倍体 3n (ABCD)(ABCD)(ABCD) 四倍体 4n (ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD) 非整倍体 单体 2n-1 (ABCD)(ABC) 三体 2n+1 (ABCD)(ABCD)(A) 四体 2n+2 (ABCD)(ABCD)(AA) 双三体 2n+1+1 (ABCD)(ABCD)(AB) 缺体 2n-2 (ABC)(ABC)三、突变的发生与修复机制外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是DNA，而导致染色体数目异常的靶部位主要是有丝分裂和减数分裂器，如纺锤丝。致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。致突变物：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传毒物。四、致突变试验与致突变作用评价观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。主要目的：①检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；②检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。观察项目的选择基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(geneticmdpoint)。正常DNADNA损伤DNA修复过程未修复的DNA损伤表达断裂的DNA分子染色体结构异常基因突变细胞死亡非整倍体多倍体重组事件SCE有丝分裂性交换染色体分离异常细胞屏障遗传毒物无误修复易错修复细胞分裂突变发生中的事件及遗传学终点的关系常用的致突变试验1、细菌回复突变试验（Ames试验）2、哺乳动物细胞基因突变试验3、果蝇伴性隐性致死试验4、染色体畸变分析5、微核试验6、姐妹染色单体交换试验7、显性致死试验8、小鼠可遗传易位试验9、细菌DNA修复试验10、程序外DNA合成实验11、精子畸形试验12、小鼠特异基因座试验2009-6-30 上一内容 回主目录返回 下一内容返回 上一内容 下一内容 回主目录致突变试验组合的原则一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。试验菌株： 鼠伤寒沙门氏菌——Ames试验 大肠杆菌——大肠杆菌回复试验1、细菌回复突变试验Ames试验原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养琼脂平板上不能生长。鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突变株(his-)正向突变回复突变代谢活化系统受试物有点试验和掺入试验两种。应分别进行不加及加代谢活化系统的试验，常用为S9混合液，即用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆经9000g离 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子。 Ames试验标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变，TA100检测碱基置换突变，TA102对醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。 这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，检测时提高试验敏感性。 Ames试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变成野生型(his+)，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此平板上生长成可见菌落。　　如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。结果判断 只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。 加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。常用细胞株选用的基因座小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK、HPRT中国仓鼠卵巢组织细胞（CHO）HPRT中国仓鼠肺组织细胞（V79）HPRT人淋巴细胞HPRT2.哺乳动物细胞基因突变试验(mammaliancellgenemutationassay)TK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷＋ATP→胸苷酸。存在嘧啶类似物5-溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。（1）TK基因座次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤＋鸟嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸→核苷-5’-单磷酸（NMP），补充途径。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变——HPRT-。（2）HPRT基因座制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogeneticassay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。3.染色体畸变试验体内试验：多观察骨髓细胞，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验：常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞。2009-6-30 上一内容 回主目录返回 下一内容返回 上一内容 下一内容 回主目录试验步骤 染毒：健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40mg/kg体重腹腔注射。 收获细胞：处死动物前2~4h，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸NS约5ml插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500r/min离心10min，弃上清液。 低渗：打散沉淀物，加入预温37℃的0.075mol/LKCl约6ml，混匀，于37℃低渗15~20min，再加固定液l~2ml混匀，立即以1000r/min离心10min，弃上清液。 固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温10~20min，然后1000r/min离心10min，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约0.5ml。 制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片10~15Cm高处滴片，干燥，用10％Giemesa染色液染色10~20min，轻微冲洗，自然晾干。 阅片计数。 染色体数目改变包括： 整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如3n或4n等。 非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。 染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂(B)、碎片(F)、环形(r)、交换(E)以及复合性断裂等。 小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为40条，大鼠的染色体数为42条。 读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。4、微核（micronucleus）试验无核细胞红细胞有核细胞中微核难与正常核分叶及核突出物区别微核试验**常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)或外周血细胞进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后24h采样。红细胞的分化成熟过程****Illustrationofabinuclearhumanlymphocytecontainingamicronucleus(arrow).Nuclearmaterialappearsinyellow,cytoplasminred.Acridin-Orangestaining,fluorescencemicroscopy,enlargement1000fold试验步骤 健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40mg/kg腹腔注射染毒。 小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块混匀。 以1000r/min速度离心10min，弃上清液，留下约0.5ml沉淀物混匀后，滴片两张，推片。 将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。 将固定晾干后的骨髓片，用Giemsa应用液染色10~15min，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。 显微镜观察并计数微核率。*PCE（polychromaticerythrocyte）指嗜多染红细胞，NCE（normochromaticerythrocyte）指正染红细胞，RBC（redbloodcell）指红细胞，包括PCE和NCE   PCE／NCE为评价细胞毒性的指标，代表未成熟红细胞与成熟红细胞的比值。微核试验中计算PCE／NCE比值时，每只动物应至少计数200个红细胞（即：PCE+NCE≥200个） PCE呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，NC呈蓝紫色。 PCE中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数1000个PCE中含微核的PCE数。结果分析与评价 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 PCE/NCE为评价细胞毒性的指标：正常PCE/NCE比值约为l（正常范围为0.6～1.2）；如PCE/NCE＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如PCE/NCE＜0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。**Giemsa染色 PCE胞质内含有核糖体，染色呈灰蓝色；MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色 NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。***　结果示小鼠骨髓嗜多染红细胞中一个微核（MN）示小鼠骨髓正常嗜多染红细胞（NCE）***示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核（MN）****示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核（MN）**显性致死指发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，导致受精卵或发育中的胚胎死亡。一般认为显性致死主要是由于染色体损伤的结果。显性致死试验以胚胎死亡为观察终点，用于检测受试物对动物性细胞的染色体损伤作用。一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予以评价。5.显性致死试验(dominantlethalassay)6.程序外DNA合成试验(unscheduledDNAsynthesistest，UDS)当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培养液中进行培养。利用放射自显影法或液闪计数法测定掺入DNA的放射活性，检测DNA修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。精子畸形指精子形态发生异常改变。可导致生育能力的改变。用于检测外源化学物对精子生成和发育的影响，也可用于评价化学物对生殖细胞的致突变作用。常用6~8周的小鼠，连续5天染毒。在染毒后不同时间（1、4、10周）处死，取样检查精子形态。7.小鼠精子畸形试验精子形态五、致突变试验中的一些问题1、阴性、阳性对照的设立（1）阴性对照即未处理对照或溶剂对照。（2）阳性对照是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。2、体外试验的活化系统许多化合物不具有致突变性，经哺乳动物代谢才转变成致突变物3、致突变试验与致癌试验的关系遗传毒性和致癌性分类：致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌物。我国卫生部在《食品安全性毒理学评价程序》(2003)中对遗传毒理学试验的要求是：考虑原核细胞与真核细胞、体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则。从①Ames试验或V79/HGPRT基因突变试验、②骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、③TK基因突变试验、小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析选一项。其他备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验、非程序性DNA合成试验。1.如三项试验中，体内、体外各有一项或以上试验阳性，则表示该受试物很可能具有遗传毒性和致癌作用，放弃。2.如三项试验中一项体内试验阳性或两项体外试验阳性，则再选两项备选试验（至少一项体内试验）。如再选的试验均为阴性，则可继续将进行下一步的毒性试验；如其中有一项试验阳性，则结合其它试验结果，经专家讨论决定，再做其它备选试验或进入下一步的毒性试验。3.如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验。*Nucleosome核粒chromatin染色质********PCE（polychromaticerythrocyte）指嗜多染红细胞，NCE（normochromaticerythrocyte）指正染红细胞，RBC（redbloodcell）指红细胞，包括PCE和NCE   PCE／NCE为评价细胞毒性的指标，代表未成熟红细胞与成熟红细胞的比值。微核试验中计算PCE／NCE比值时，每只动物应至少计数200个红细胞（即：PCE+NCE≥200个）***********