一、实验目的：1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。二、实验原理:1、电泳：定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3)SDS-PAGE分类：SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（合而成。在具有自由基时，AcrAcr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（和Bis就会聚合。Bis）在催化剂作用下聚引发产生自由基的方法有两种：①化学法②光聚合法①化学聚合：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；②光聚合：催化剂是核黄素（VB2），在痕量氧存在下，核黄素光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。聚合反应：聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：①聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；②链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；③网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；④长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；⑤该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。凝胶的质量决定因素：（1）凝胶度：是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂（Bis）的总克数，用T%
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示。（2）交联度：是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数，用C%表示。一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和C(交联百分浓度)。上式中：a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液体积（ml）。当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4％时，有效孔径最小，C大于或小于4％时，有效孔径均变大，C大于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6％和3。a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。常用29：1不连续PAGE的原理：第一、三个不连续性：①凝胶孔径的不连续；②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续；③在电场中形成的电位梯度的不连续。第二、不连续系统中的三种物理效应：①电荷效应：②分子筛效应:③浓缩效应:不连续PAGE电泳胶体系统的组成：在浓缩胶中的三个主要作用角色：浓缩效应：三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)2、仪器、器皿：垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；稳流稳压电泳仪；（3）高速冷冻离心机；4）电子天平；（5）电冰箱；6）瓷盘、微量进样器；3、试剂：1）丙烯酰胺凝胶贮液（Acr-Bis贮液）；2）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：3）浓缩胶缓冲液（pH6.7Tris-HCl缓冲液）：4）10%SDS溶液：6）TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)；7）样品提取液：8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）9）40%蔗糖：染色液脱色液四、实验步骤：1、贮液的配制：2、凝胶的制备：2.1胶板的制备：2.2分离胶的制备：按下表制备分离胶(T=10%,pH=8.8)胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。2.3浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶(T=4%，pH=6.7)用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→封水，聚合。3、植物组织蛋白质提取：称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加入在冰上静置（3小时）。4℃条件下条件下，11100rpm离心20min，提取上清夜，样品制备完成。4、装槽、点样：3ml样品提取液，取出胶板下端胶条→用滤纸擦净凡士油→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→上下槽装电极缓冲液。轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约25μl5、电泳：接通电源→稳流→调节电流到每孔1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm停止电泳。6、剥胶、染色、脱色：将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入染色液，过夜。染色完毕后，倒出染色液，并换脱色液5-6次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质区带清晰为止。五、结果与计算：绘制蛋白质谱带，计算出迁移率；六、思考题：1、影响电泳的主要因素有哪些？2、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续，及三种物理效应。
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