头孢菌素C发酵过程代谢特性

V01．32No．11 华东理工大学学报(自然科学版) 2006—11 JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology(NaturalScienceEdition) 1275 文章编号：1006—3080(2006)11—1275一05 头孢菌素C发酵过程代谢特性 冀志霞1， 储 炬1， 庄英萍1， 张嗣良1， 罗家立2， 白 骅2 (1．华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，国家生化工程技术研究中心，上海200237； 2．浙江海正药业股份有限公司，台州318000) 摘要：考察了头孢茵素C的发酵过程特征，对发酵过程的重要生理参数DO、CER、OUR、RQ 等进行了在线检测和相关 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，并分析了比生长速率和比产物生成速率的变化规律。在发酵过程中 0UR、CER最高分别达到了90．2m01／(m3·h)和69．8mol／(m3·h)， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明头孢菌素C发酵代谢强 度很大，对氧的需求量也非常大。比产物生成速率在发酵60～100h最高达到2．15U／(h·g)(细胞 干重)。同时分析了头孢茵素C发酵过程中甲硫氨酸代谢规律，表明维持培养基中一定浓度的甲硫 氨酸对头孢茵素C的合成有促进作用。通过对三级发酵和四级发酵的比较，表明在现有的设备和 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 条件下，三级发酵生产头孢茵素C要优于四级发酵，同时通过控制发酵前期茵丝浓度可获得 最大产素水平。 关键词：头孢菌素C；发酵；代谢特性；甲硫氨酸 中图分类号：TQ920．6 文献标识码：A MetabolicPropertiesofCephalosporinCFermentation JIzh|一zi口1，CHUJ0，zHUANGY诹g—p讽91，zHANGsi—Ka住矿，moJia—ci2，BAIHu矛 (1．S￡口tPK眵yL口60r口￡D，≯o，Bio，℃口f芒orE咒gi咒P已，．i咒g，Ⅳ口￡io咒口ZE咒gi咒PPri，zgRPsP以，．f^Ce咒￡P，．／'Dr Bio￡Pc^咒。厶川雪y(5^口咒g^口i)，E以sfC冼i咒口【，咒i口已rsi砂。厂SciP，zc已以咒d7■f^行oZogy，S^口咒g^以f200237，(冼i咒口； 2．Z^巧i口咒g．His甜咒P^口，‘，扎盘fP“fZf口ZCD．L￡d．，丁口i名^o“318000，C冼西2口) Abstract：FermentationprocessofcephalosporinCwasstudied．TheDO(dissolvedoxygen)tension， CER(carbondioxideevolutionrate)，OUR(oxygenuptakerate)andRQ(respiratoryquotient)weremoni— toredonlineandthespecificgrowthrate，specificproductionratewereanalyzed．ThehighestCERand OURare90．2mol／(m3·h)and69．8mol／(m3·h)respectively．ItrevealsthatcephalosporinCbiosyn— thesisisahighoxygendemandingprocess．ThespecificproductionratereachesitshighestValueat60～ 1OOh．Atthesametime，methioninewasanalyzedoff1ine．ForcephalosporinCbiosynthesisitisessential tokeepmethionineconcentrationatcertainlevelinthebroth．BycontroUingthebiomassattheearlier stageoffermentationundertheexistingequipmentsandaircompressioncapacity，thefermentationwith twicepreculturesisfoundtobesuperiortothatwiththricepreculturesintermsofproductiVity． ’Keywords：cephalosporinC；fermentation；metab01icproperties；methionine 头孢菌素类抗生素属于伊内酰胺类抗生紊，头 收藕日期：2005—10—08 基金项目：上海市科委重点科技攻关项目(034319220) 作者简介：冀志霞(1973一)，女，湖北武汉人，博士研究生。 通讯联系人：张嗣良，E—mail#siJja“gz@ecust．edu．cn 孢类药物的制备，除部分由青霉素G扩环裂解成7一 ADCA(7一氨基一3一去乙酰氧基头孢烷酸)后进行结构 改造之外，绝大多数是由头孢菌素C或脱乙酰头孢 菌素C经裂解制取，头孢菌素C在半合成头孢菌素 中具有重要作用。近年来头孢类药物的消费量持续 万方数据 华东理工大学学报(自然科学版) 第32卷 上升，目前国内头孢菌素原料药需求量年增长率约 为12％～15％[1]。因此对头孢类药物的原料需求也 不断增加，而头孢类药物的发展则取决于头孢菌素 C的生产水平。 对头孢菌素C发酵水平的影响除了菌种的因 素外，还有发酵的过程控制。在发酵过程中，随着菌 体生长和基质消耗，过程状态随时间而变化，发酵过 程参数表征细胞代谢特性与工程特性，测量参数的 时变性反映了发酵过程的时变系统特征。由于物质 理化性质，如搅拌转速、空气流量、罐压力，酸碱加入 量等，以及细胞的生长代谢引起参数之间耦合相 关[2]。基于过程参数相关分析优化的发酵过程已成 功地应用于鸟苷、红霉素、青霉素和人血清白蛋白等 的生产，通过参数分析，并与发酵过程的特征现象关 联，能有效实现过程优化。头孢菌素C发酵过程离 线和在线参数检测包括中间代谢产物、前体、有机 酸、氨基酸、蛋白质以及头孢菌素C合成途径的酶 等[3]，但是结合尾气参数CER、OUR、RQ中与其他 参数进行相关分析的较少。本文主要考察头孢菌素 C发酵过程的DO、CER、OUR、RQ以及pH、菌浓 等参数的变化规律，对头孢菌素C的代谢特性进行 研究，调整发酵过程参数，从而实现头孢菌素C发 酵工艺的优化。 1材料与方法 1．1实验材料 1．1．1 茵种 顶头孢霉菌(C劫肠ZD眵D一“m口c化一 mo咒i“m)HS02，浙江海正药业股份有限公司提供。 1．1．2培养基(g／L)葡萄糖16．7，蔗糖3．3，玉米 浆70．o，豆油10．o，D，L一蛋氨酸6．O，KH2P044．0， (NH‘)2S048．O，FeS04·7H20O．05，CaC0310．O， pH6．2。 1．1．3发酵罐80m3发酵罐，搅拌桨3层，6弯叶 涡轮式搅拌桨，d／D—o．33，搅拌桨叶尖线速度为 3．98m／s。 1．2实验方法 1．2．1 总糖和还原糖的测定 费林试剂法[4]。 1．2．2 甲硫氨酸的测定 Agilentll00色谱工作 站，ZORBAXEclipseAAA分析柱200mm× 4．6mm，流动相：(A)40mmol／L磷酸氢二钠，pH 7．0；(B)y(乙腈)：y(甲醇)：y(水)=45：45： 10；衍生剂：OPA，FMOC；紫外检测波长：一级氨 基酸：338nm；二级氨基酸：262nm。 1．2．3尾气分析 尾气分析使用VGPrima艿B型 质谱仪，最后的数据处理、通讯和相关分析通过华东 理工大学国家生化工程技术研究中心自行开发的上 位机软件包《发酵过程检测系统B10RADAR2．O》 完成‘5。。 1．2．4头孢茵素C效价测定方法 HPLC法。色 谱柱：TSKgelODS一100S250mm×4．6mm，10 肛m；流动相：y(醋酸铵缓冲液20mmol／L， pH5．6)：y(乙腈)一94：6，流速：1．omL／min，紫 外检测波长：254nm，窒温，进样量20肛L。 1．2．5 茵丝浓度测定湿菌体(PMV)采用离心法 计算，取10mL发酵液，3000r／min离心15min， 计算固形物体积占发酵液的比例；干重：发酵液过滤 获得菌丝体，菌丝体用去离子水洗2～3次，获得湿 细胞，然后将湿细胞烘干至恒重，得细胞干重。 1．2．6三级发酵与四级发酵培养方法三级发酵： 一级种子(种龄76h)一二级种子(种龄40h)一发 酵，一级种子接入二级种子、二级种子接人发酵罐的 接种量分别为10％和17％；四级发酵：一级种子(种 龄64h)一二级种子(种龄35h)一三级种子(种龄 30h)一发酵，一级种子接入二级种子、二级种子接 入三级种子、三级种子接入发酵罐的接种量分别为 10％、10％和17％。 通过压差法接人，培养130～150h，40h前28 。C，40h后控制为25。C。过程控制根据实验情况调 整。补料用硫酸铵、豆油根据需要独立补入。 2结果与分析 2．1头孢菌素C补料分批发酵过程曲线 2．1．1DO、CER、OUR、RQ的变化与头孢菌素C 的合成 由图1可知，顶头孢霉菌菌体的适应期非 常短暂，5～10h后开始明显生长，表现在pH、DO 和总糖逐渐下降，CER和OUR同步逐渐增加。在整 个发酵过程中，OUR和DO的变化呈现很好的相关 性，OUR上升时DO下降，反之亦然。同时CER、 0UR与菌体的生长和次级代谢产物的合成也密切 相关。在发酵25h时，CER和OUR的上升出现短 暂的停顿，之后继续上升，但是CER和OUR出现 分支后，OUR上升的幅度大于CER；此时RQ值也 发生变化，由1．o下降为o．675，之后在45h左右， RQ值稍有上升后一直维持在O．6～O．7。CER与 OUR增长的非同步性以及RQ值的变化与菌体对 不同类型碳源的利用情况有关，当RQ在1．0时菌体 以葡萄糖为碳源，o．6～0．7则主要以豆油为碳源。不 同底物的利用与培养基中各种酶的活力水平有关， 万方数据 第1l期 冀志霞，等：头孢菌素c发酵过程代谢特性 星 f／h 图1头孢菌素C发酵过程曲线 Fig．1TimecourseofcephalosporinCfermentation 文献报道淀粉酶活力在20h时开始增加，70h时达 到最高；脂肪酶活力也是在20h开始增加，40～120 h维持在一个较高的水平[6]，这与本文由CER、 OUR和RQ得出的菌对碳源的利用结论一致。 在63h左右，CER和OUR上升到峰值，CER 为69．8mol／(m3·h)，OUR为90．2mol／(m3·h)， 表明头孢菌素C发酵是一个高耗氧的过程。从头孢 菌素C的生物合成途径也可以看出，有3步反应都 需要氧[7]，因此在头孢菌素C的发酵过程中氧的供 给非常重要。在100h，D0下降到20％，最低时达到 10％以下，同时OUR和CER也开始下降直至放 罐，由此初步推测头孢菌素C发酵过程临界氧的水 平是在20％左右，与文献[8]的报道一致。说明在 100h后DO逐渐低于临界氧，对菌体代谢造成很 大的伤害，可能引起部分菌自溶。 2．1．2发酵过程中比生长速率(∥)与比产物生成 速率(q，)变化发酵过程中p和g，的变化见图2， 发酵25h时卢速率最大，为1．17×10-2h～。25h之 后不断下降，菌体生长放缓，进入次级代谢产物合成 期，gp在40h时为1．61U／(h·g)(细胞干重，下 同)，40～60h逐渐上升，60～100h维持在2．15U／ (h·g)，是产物大量合成时期，100h之后DO已低 于20％，达到了临界氧水平[8]，菌的代谢受到抑制。 gp迅速下降，在120h左右为o。研究表明由于氧限 制，菌体代谢无法正常维持，造成产物合成停滞。 2．2 甲硫氨酸对头孢菌素C合成的影响 2．2．1 甲硫氨酸浓度对头孢茵素C合成的影响 甲硫氨酸在头孢菌素C合成中的作用已有大量的 研究，它能被胱硫醚一r一裂解酶裂解，通过反转硫途 径转化成半胱氨酸，为头孢菌素C的合成提供前 体[93；还能够诱导头孢菌素C生物合成途径中相关 酶的形成，从而刺激产物的生成[10|。鉴于各菌株的 p k 圣 。 专 图2头孢菌素C发酵过程中比生长速率(∥)与比产物生成 速率(gp)变化趋势 Fig．2Timecourseofspecificgrowthrate(∥)andspecific productionrate(gp)ofcephalosporinCfermenta— tion 遗传及表型差异，在基础料添加不同浓度的甲硫氨 酸，考察了甲硫氨酸对本实验菌株头孢菌素C生物 合成的影响，结果见表1。在未加甲硫氨酸的情况 下，头孢菌素C效价很低，表明甲硫氨酸对于头孢 菌素C的合成是必需的。随着甲硫氨酸浓度的增 加，头孢菌素C的效价不断增加，甲硫氨酸浓度为 6．0g／L时，达到1．75×104U／mL，但是甲硫氨酸的 浓度增至9．0g／L时，效价不但不增加，反而下降， 这可能是由于培养基中较高浓度的镀抑制了次级代 谢产物酶的合成，从而抑制了产物的生成[1¨。 裹1 甲硫氨酸浓度对头孢菌素C合成的影响 Table1 Influenceofmethionineoncephalosporin Cbiosynthesis c(Methionine)／(g·L一1)Potency／(104U·mL一1) ^b早，FoI)＼Aog羞 ∞ 舳 印 柏 加 O—Hb．∞。置．Io吕v＼√Hflo，国山u．一装一。口 O 8 6 4 2 O l O O 0 O 7 6 5 4 3 2 l 墨A‘(长一急∞暑∞蚕oJ． 万方数据 1278 华东理工大学学报(自然科学版) 第32卷 200 O．05 O．04 O．03 O．02 0．Ol 0 ， ■ 3 j ．量 g 雹 E 1．0百 j 勺 o．5星 O f／h 图3 甲硫氨酸的代谢规律及其与比产物生成速率的相关性 Fig．3TimecourseofmethionineuptakingduringcephalosporinCbiosynthesis ■一Methionineuptakerate；▲一Residualmethionine}●一specificproductionrate；△一Introcellulermethionine 2．2．2甲硫氨酸在头孢菌素C发酵过程中的代谢 规律如图3，甲硫氨酸在发酵初期就被快速利用， 20h后在细胞内大量积累最高可达到167mg／L， 32h时消耗速率达到最大，为o．048g／(L·h)，40h 即进人头孢菌素C的合成期后，胞内积累甲硫氨酸 已被大量利用，只有69．07mg／L，可能与刺激菌形 转化成膨大菌丝有关。甲硫氨酸的消耗速率有两次 高峰，一是20～50h，即菌体生长后期，产物形成的 启动期；二是70～90h，为产物大量合成期，而且启 动期的消耗速率要比产素期高。甲硫氨酸能够引起 菌丝形态变化，促使菌丝膨大、断裂和形成节孢子， 而菌丝形态的改变与头孢菌素C的合成密切相关。 进一步研究表明甲硫氨酸能明显提高编码头孢菌素 C合成途径的酶基因的转录水平，如ACV合成酶 和扩环酶／羟化酶等[9~10|。因此甲硫氨酸不仅是作 为氮源用于菌体生长，更重要的是在前期诱导调节 头孢菌素C的合成。在产素期甲硫氨酸除了可作为 氮源外，可能更主要的是作为硫源被利用，通过反转 硫途径为头孢菌素C合成提供前体氨基酸——半 胱氨酸。在初始培养基中添加大量的甲硫氨酸，并在 发酵过程中特别是在头孢菌素C的大量合成期间， 维持培养基中一定浓度的甲硫氨酸对其合成有促进 作用。 2．3三级发酵与四级发酵比较 2．3．1OUR、CER与RQ的比较随着发酵的进 行(如图4)，CER和OUR不断上升，三级发酵和四 级发酵的CER和OUR都在20h时出现分支，之后 继续上升；在60h时四级发酵的CER和OUR达到 最大，分别是52．0、83．2mol／(m3·h)；而三级发酵 的CER和OUR在70h左右才达到最大，分别是 46．6、71．1mol／(m3·h)；四级发酵的CER和OUR 都比三级发酵高，表明四级发酵对氧的需求比三级 发酵高。在四级发酵中，0UR上升至最高时DO降 至低谷，由于此时DO已不能满足生产菌的需求， OUR在到达最高点后一般即开始迅速下降，造成菌 的活力受到损害，菌不能正常产素。而三级发酵的 OUR在上升到最高点后能够在这一水平维持一段 时间(20～30h)，这样菌就能维持一定的活力继续 产素。CER的变化和OUR基本一致，四级发酵的 CER也是在70h左右达到最大后迅速下降，而三 级发酵的CER在达到最高后同样能够在这一水平 维持一段时间。 图4 三级发酵和四级发酵的Do，CER，0UR和RQ比较 Fig．4ComparisonofD0(a，A)，CER(b，B)，0UR(c，C) andRQ(d，D)betweentertiaryclass(smaUletter) andquaternaryclassfermentation(capitalletter) RQ的变化在三级发酵和四级发酵中都有一个 先上升再下降的过程，但不完全相同(如图4)，都是 在20h时升到1．o，20h之后迅速下降，四级发酵的 RQ在30h时降到O．6～0．7后一直维持到放罐，而 三级发酵RQ在30～50h短暂回升，但比20h之前 低，60h后RQ一直稳定在0．6～o．7。RQ的变化一 一『I；I．_b．∞一＼o_．E'J廿u，口厶暑u口一．【_o一专Q_五 ∞ 加 舳 加 O ^．b．嚣g一＼箸luo一专Q昌矗昌一一8重 万方数据 第11期 冀志霞，等：头孢菌素C发酵过程代谢特性 方面与碳源的利用情况有关，另一方面与代谢途径 有关。30～50h三级发酵与四级发酵RQ的不同可 能和这两方面因素都有关，还需要进一步研究。 2．3．2DO水平的比较四级发酵的DO在50～ 60h迅速降到20％以下(如图4)，之后D0一直保 持在15％左右直至放罐，表面上看还有15％的 DO，似乎还能够维持产素，但实际上此时的DO值 并不能体现罐内的真实DO水平，特别是在80h之 后，OUR的变化与DO呈顺峰关系，表明此时已处 于临界氧浓度以下，供氧不足已经导致0UR下降， 而三级发酵的DO在90h时才降到20％以下。 四级发酵对氧的需求比三级发酵要高，主要是 两方面的原因造成的：一方面是菌浓，四级发酵的菌 浓比三级发酵高，前者在42h时菌浓为124．8g／L， 而后者的菌浓仅为98．8g／L，即随着菌量的增加也 加大了对氧的需求；另一方面较高的菌浓和增大的 补油量，增加了发酵液的粘度，使氧的传递受限，同 时油的氧化分解也需要消耗大量的氧，加大了氧的 供需矛盾。 2．3．3 比生长速率卢和产素速率的比较 四级发 酵种子转入发酵后活力较强，菌浓比较高，起始的比 生长速率卢为1．755×10_2h_1(如图5)，反应一开 始卢就下降，10h后快速下降，26h时下降到第一 个峰谷，为7．93×10qh_。。而三级发酵中26h时∥ 达到最大，为1．165×10_2h～，但比四级发酵初始 的∥低，之后产不断降低，开始合成次级代谢产物。 四级发酵中在40h和90h左右又分别出现两次∥ 的峰值，而40h是产素开始大量合成的启动时期， 2．0 1．6 }1．2 o ：：O．8 过 0．4 O 图5 三级发酵和四级发酵的比生长速率和 产素速率的比较 Fig．5Comparisonofspecificgrowthrate(square)and productionrate(triangle)betweentertiaryclass (closesignal)andquaternaryclassfermentation (opensignal) 90h是次级代谢产物的大量合成期，故在头孢菌素 C的合成过程中，限制一定的∥才能保证头孢菌素 C的正常合成。 虽然四级发酵的菌浓比三级发酵高，但比产物 生成速率一直在下降，而且在产物大量合成期远远 低于三级发酵，但补料并未减少，特别是在产素停滞 后氨水仍然能够补人，说明代谢途径已发生迁移。因 四级发酵的中后期发酵液非常粘稠，使得氧传递受 限，造成在临界氧水平以下发酵，有机酸大量产生， 补入的氨水没有用来产素而是用来中和产生的大量 有机酸。因此，发酵前期控制菌的生长是关键，可以 通过控制比生长速率卢来控制发酵的进程，通过降 低菌的生长速率，以限制菌对氧的需求，这样就能有 效地利用现有的设备条件，最大限度地提高生产 效率。 总之，在头孢菌素C的大量合成期60～100h 期间，三级发酵的DO能够维持较高的水平满足头 孢菌素C生物合成对氧的需求，而四级发酵中因供 氧和需氧的矛盾突出极大地影响到产素水平，导致 四级发酵的产素速率远远低于三级发酵，因此在目 前的设备和生产条件下三级发酵的生产效率要比四 级发酵的高。 3 结论 头孢菌素C的合成是生长部分耦联型，在发酵 25h时比生长速率最大，为1．165×10-2h～，比产 物生成速率在60～100h达到最大，维持在2．15U／ (h·g)，是产物大量合成时期，CER最高为69．8 mol／(m3·h)，OUR最高为90．2moj／(m3·h)，RQ 值25h为1．0，45h之后维持在O．6～0．7。而甲硫氨 酸在发酵的前期，40h之前就被大量消耗，证明了 其对头孢菌素C合成的代谢调节作用，在60～100 h期间维持一定量的甲硫氨酸有利于产素。 通过对三级发酵和四级发酵的比较，表明氧的 供给不足是限制产素水平提高的关键，在现有的设 备和工艺条件下三级发酵生产头孢菌素C要优于 四级发酵；在发酵前期控制菌量，在次级产物大量合 成期限制菌的比生长速率，降低菌对氧的需求，可获 得最大产素水平。 (下转第1309页) 万方数据 第11期 李荣梅，等：(25，3S)一N一苄氧羰基一4一苯基一3一氨基一1一氯一2一丁醇的合成与结构表征 1309 图4样品的分子结构 Fig．4Molecularstructureofsample 3结论 提供了(2S，3S)一氯醇的一种化学合成新方法， HPLC—MS联用技术对(2S，3S)一氯醇进行了定性及 纯度测定，其纯度为99．9％，完全满足作为药物中 间体的要求，X射线单晶衍射法对其进行了绝对构 型的确认，为氯醇的实际应用提供了可靠的理论依 据。 参考文献： [1] [2] LulyJRA．Synthesisofprotectedaminoalkylepoxidesfrom a—aminoacids[J]．J0rgchem，1987，52：1487—1492． 杨勤刚，何煦昌，白东鲁．HIV蛋白酶抑制剂研究进展[J]．药 学学报，2005，40(5)：389—394． [3]BarluengaJ．Thefirstdirectpreparationofchiralfunction— alisedkentonesandtheirsyntheticuses[J]．Jchemsocchem Comtnon，1994，(8)：969—970． [4]HilpertH．Processformakingaphenylthiobutylisoquinoline andintermediates[P]．w0：9845271，1998一04一03． [5]HondaY． 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