组织病理技术组织处理的一般程序固定脱水浸蜡与包埋切片与染色骨和含钙组织脱钙法第一节、组织处理的一般程序迄今为止，在众多医学科学实验技术中，机体器官、组织或细胞以及亚细胞结构的形态学变化仍然是最直观和最可靠的观察指标。也是最基本的医学技术方法。本章主要介绍组织病理学技术的一般常识和常用染色方法做简要地介绍。一.标本的采集和处理在组织病理学研究中，制做高质量的组织切片是关键性的一步，切片质量的好坏直接影响着病理诊断结果的准确性和可靠性，而一张好的切片与标本的采集和处理过程有着密切的关系。二、标本的固定将组织浸入某些化学试剂中，使组织、细胞尽量保持其生活状态时的形态结构和位置，称为固定。理论上，凡需要进行病理检验的各种组织都应该进行固定。组织离开机体或机体死亡后，若不固定，细胞在自身酶的作用下会溶解破坏，结构消失，无法进行形态学检查。正确的病理诊断是建立在对病理标本正确的肉眼形态观察和显微镜形态观察之上的，切片的质量直接影响形态学观察的准确性，而一张好的切片与组织的固定和取材质量密切相关。常用固定液1.甲醛-福尔马林市面上所售的甲醛原液浓度的实际含量为40%。平常用作固定的甲醛浓度为10%，即以10ml甲醛原液加90ml水配成的，实际上只有4%的甲醛浓度。甲醛是最常用的固定液，其优点是对固定组织的穿透力强（4h穿透2.7mm;12h为5mm）.2性甲醛是人体组织、实验动物组织常用的固定液，效果优于甲醛。构成：甲醛原液120ml蒸馏水880ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠13g，使PH达7.0.3酒精-乙醇易被氧化为乙醛、乙酸。用于固定时以80%-95%的浓度为好。具有硬化、固定、脱水等作用，渗透力较弱。70%的酒精可较久保存组织。注意：50%以上浓度的酒精可溶解脂肪及类脂质，又能溶解血红蛋白及其他色素，慎用为好。三、取材在具体实验过程中，我们不可能将所有的病理组织都做成切片进行观察，所以，为达到正确观察或诊断的目的，必须采集适量的病例组织，这不仅要求标本
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要尽可能新鲜，而且要有一定的数量和质量，根据需要确定取材的部位和块数。切取组织时，应用锋利的刀、剪，刀刃宜薄，足够长。一般标本切取的组织块厚以0.2~0.3cm为宜，对于冰冻切片，取材组织块略厚度可达0.3~0.4cm，也可根据情况略作调整。若过厚则固定不好，组织结构不佳，过薄则切片张数有限，有漏掉病变部位的可能性。一般来讲，常规组织病理染色，组织块大小以1.5cm×1.5cm×0.2～0.3cm为宜用于免疫组织化学染色的组织块，以1cm×1cm×0.2cm为好；用于电镜观察的组织块要小，以1mm×1mm×1mm为宜。动物标本在取材前要尽量避免动物过度疲劳，迅速将动物杀死。实验室中多采用麻醉法，动物麻醉后即可根据实验的目的要求进行取材。四、脱水、透明、浸蜡、包埋固定好的标本需流水冲洗12-24h。1.脱水：组织固定好后，在透明、浸蜡前应先将组织中的固定剂以流水冲洗数小时，由于水不能与二甲苯及石蜡相结合，所以需先脱去组织中的水分。常用脱水剂：酒精、丙酮、正丁醇等，但酒精既能脱水又可与透明剂二甲苯互溶，使组织硬化。故常用酒精。.脱水步骤和时间70%1-2h80%2-4h90%2-4h95%2-4h99.9%2-4h99.9%2-4h脱水应彻底干净，组织脱水是否彻底，与酒精浓度，特别是最后两次无水酒精浓度直接相关。2、透明组织经酒精脱水后，还必须经过一个浸蜡的媒剂透明过程。因为酒精不能溶解石蜡，所以在浸蜡前需要既能结合酒精又能与石蜡相溶的媒剂，以便石蜡渗入到组织中去。笨和二甲苯都可使组织透明，常用二甲苯。透明步骤：低高梯度透明。3、浸蜡经过透明的组织块，进一步移入熔化的石蜡内浸渍，其目的是以石蜡置换组织块中的二甲苯，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，一边切成薄片。浸蜡步骤：熔化的软蜡中等硬度石蜡熔化的硬蜡。4、包埋组织包埋的方法有多种，如石蜡包埋法、火棉胶包埋法等；常用的为石蜡包埋法。步骤：1）.金属包埋框（模具）置入温箱内烘热待用2）.将石蜡放入恒温烤箱内熔化3）.取出烘热了的包埋框，迅速将烤箱内的溶蜡倒入框内，再用加热的镊子取组织块，将其置入框底，用镊子轻轻压平。五、石蜡切片将包买好的蜡块固定在切片机头上。切片厚度一般不超过5微米；将切下的薄片用毛笔和镊子摊于40度左右的热水容器中，含石蜡的切片即行展开。用载玻片插入其下，将组织片轻轻捞起，最后将切片置于60度的温箱烤30-60min，使切片牢贴与载玻片上，同时将蜡熔化。为了防止脱片，捞片前可用蛋白甘油涂片后再捞。第二节、染色程序与方法常规石蜡切片HE染色大体分三个步骤：一、染色前切片脱蜡水洗1.梯度二甲苯脱蜡；2.梯度酒精脱二甲苯；3.自来水洗4.蒸馏水洗二、染色1.苏木精染5-15min2.自来水洗3-5min3.1%盐酸酒精1-5秒4.自来水洗1-5min5.弱碱性溶液30-60秒6.自来水洗5-10min7.蒸馏水洗1-2次8.伊红溶液染5-10min9.蒸馏水洗1-2次三、脱水、透明、封固1.梯度酒精脱水2.梯度二甲苯脱去酒精3.中性树胶封固。骨和含钙组织脱钙法一、硝酸脱钙法1、固定组织大小固定液2、1%硝酸和70%酒精3、每天换液两次，24—36H4、流水冲洗12—24H二、甲醛缓冲液、减缓液脱钙法1、甲醛缓冲液40%甲醛90ml磷酸氢二钠3、6克加蒸馏水至300ml；2、减缓液缓冲液275ml90%甲酸13ml37%Hcl13ml；用时每100ml加0、5g亚铁化钾方法；将骨片置于甲醛缓冲液、减缓液内1、5H；用法70%酒精洗三次脱水、透明、浸蜡、染色
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