核增生李斯特氏菌检测概述(1)教学内容

核增生李斯特氏菌检测概述(1)内容简介李斯特氏菌属单核增生李斯特氏菌生物学特性流行病学致病性实验室危害及其预防检测程序快速检测方法李斯特氏菌属李斯特氏菌属（Listeria）普遍存在于环境中，最新的分类学研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeriaivanovii）无害李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。生物学特性---菌体形态及染色特征革兰氏阳性；小的、类似球形杆菌，0.4~0.5×0.5~2µm，在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成V形，或成群的细胞沿长轴方向平行排列，在较老的或生长不良的培养物中，可能形成丝状；20-25℃以4根周生鞭毛运动，在37℃只有较少的鞭毛或1根鞭毛；无芽孢、无荚膜。生物学特性---培养特性兼性厌氧；在20--25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃。pH范围pH4.4-pH9.6。生物学特性---培养特性在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。生物学特性---生化反应触酶阳性，氧化酶阴性。能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。生物学特性---血清型根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。生物学特性---抵抗力该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。流行病学分布：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播寄主范围：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫流行病学据报道，有1-10%的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收的食品种类（来源：USDA及FDA报告）致病性及其治疗该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产或死婴、脑膜炎、败血症直至死亡。由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达70%，败血症的死亡率达50%，围产期或新生儿感染的死亡率超过80%，怀孕期妇女的感染，母亲通常能存活下来。抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。感染人群感染剂量未知，但与该菌的毒力和易感人群的年龄、免疫状态有关。易感者：孕妇/胎儿—围产期和新生儿的感染；接受皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植治疗、艾滋病患者等免疫缺损者；癌症病人—尤其是白血病的患者；不太常见的报道—糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结肠炎的患者；年纪较大的人；没有免疫缺陷的健康的人，食用污染该菌尤其是大量污染该菌的食品后，也有患病的危险。致病机理单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，有α和β两种，为毒力因子。实验室危害不是一种普遍的与实验室相关的传染病，目前只有少数有报道的案例发生；直接摄取是最普遍的一种感染方式，除此之外，暴露在该菌高浓度的气溶胶中，也可通过眼睛和破损的皮肤、粘膜进入体内造成感染。注意事项生物安全2级，操作时应有相应的防污染设施，在进行可能产生气溶胶的操作时，应在生物安全柜内完成；在直接接触有感染性的材料时，必须穿着实验服，戴手套和护目镜；怀孕的妇女应避免接触传染物。操作 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 溅洒：使气溶胶沉降，穿着防护服装，用纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入1%次氯酸钠溶液，由周边向中心加，在清理之前要留充足的接触时间（30min）；废弃：在废弃前应先采取净化措施，高压蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等；储存：在有适当标记的密封容器内储存。检测程序---增菌目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、Fraser肉汤（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）半量Fraser肉汤和Fraser肉汤具有选择性和区别性。加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区别的作用。李斯特氏菌可以水解七叶灵，与培养基中的铁离子反应，使培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有单核李斯特氏菌的生长。氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用的添加剂一样半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/LFraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄的25mg/LUVMUVM只有选择性没有区别性加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性因子。虽然其中含有七叶灵，但是没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应。LEB和BLEB只有选择性没有区别性LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠检测程序---分离分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首选仍然是OXA。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是检测由毒力基因编码的溶血素，而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的将此两种菌同李斯特属的其他种分开。OXA平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培养OXA平板无害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培养检测程序---鉴定蓝色菌落检验（Henryillumination）典型运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头动力试验：7天，伞形生长过氧化氢酶试验：阳性革兰氏染色：阳性短杆菌溶血试验：穿刺接种血平板硝酸盐还原试验：5天，阴性糖发酵试验：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性，李斯特其他种甘露醇阴性，木糖和鼠李糖最有检测意义动力试验血平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培养血平板无害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培养血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培养单核增生李斯特氏菌检测流程25g样品+225mlBLEB基础（加入丙酮酸钠）加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮30℃4hr划线接种OXA平板30℃24hr和48hr科玛嘉李氏菌显色培养基TSA-YE分纯35℃24hr-48hr35℃24hr过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃24-48hr报告结果35℃18-24hr方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验*无未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-2003EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、典型运动）；生化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力试验；协同溶血无LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三种抑菌剂（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七叶灵+Fe3+推荐BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria蓝色菌落*；典型运动或动力试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血；血清学检验；小鼠毒力试验*筛选、鉴定都可以使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步鉴定：纯菌菌落形态；典型运动；生化鉴定：MICRO-ID®Listeria或Api®Listeria或BAM等方法中的传统生化反应；协同溶血遗传鉴定：核糖体RNA检测；PFGE*筛选用的快速方法必须经过确认后才可使用鉴定中用到MICRO-ID®、Api®、GenProbeAccuProbe®、GENE-TRAK®各官方方法比较各官方方法比较方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM典型运动或动力试验；溶血试验；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速鉴定试剂盒*；过氧化氢酶*；革兰氏染色*；协同溶血*；血清学试验*作为鉴定的可选步骤，允许使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe™ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉汤（30℃，24±2h）Fraser肉汤（35或37℃，48±2h）OXA和PALCOM（30、35或37℃，24-48h，）PALCOM平板微需氧或好氧条件培养蓝色菌落*；过氧化氢酶；革兰氏染色；动力试验或典型运动*；溶血试验；糖发酵试验；协同溶血；送参考实验室（血清或噬菌体分型）无NMKLNo.1362nd1999LBⅠ（30.0±1.0℃，24±3h）LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉汤（37.0±1.0℃，48±4h）OXA和PALCOM（37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧）溶血试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；典型运动动力试验；糖发酵试验；送参考实验室（血清、噬菌体、DNA或酶分型）允许使用经过确认的商业化生产的单核增生李斯特氏菌菌株鉴定试验，但没列明具体试剂盒名称红肉、禽、蛋和环境样品中分离和鉴定单核增生李斯特氏菌的方法红肉、禽、蛋和环境样品中分离和鉴定单核增生李斯特氏菌的方法FDA：李斯特氏菌属的快速筛选试剂盒Table2. ListeriaGenusDetectionTestKitsPrescribedforRegulatoryScreeningAOACOfficialMethod993.09.2000.Listeriaindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricdeoxyribonucleicacidhybridizationmethod(GENE-TRAKListeriaAssay).(3,14)AOACOfficialMethod994.03.2000.Listeriamonocytogenesindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricmonoclonalenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod(ListeriaTek).(5,15,32)AOACOfficialMethod995.22.2000.Listeriainfoods.Colorimetricpolyclonalenzymeimmunoassayscreeningmethod(TECRAListeriaVisualImmunoassay[TLVIA]).(6,30)AOACOfficialMethod996.14.2000.Assurance(PolyclonalEnzymeImmunoassayMethod).(7,21)AOACOfficialMethod997.03.2000.VisualImmunoprecipitateAssay(VIP).(8,22)AOACOfficialMethod999.06.2000.EnzymeLinkedImmunofluorescentAssay(ELFA)VIDASLISAssayScreeningMethod.(9,23)FDA：生化鉴定的替代方法VitekAutomicrobicGramPositiveandGramNegativeIdentificationcards(bioMerieux,Hazelwood,MO)APIListeria(bioMerieux,Marcy-l'Etoile,France)whichdoesnotrequireanadditionalCAMPtestTheMICRO-IDTMkit(bioMerieux,Hazelwood,MO;1,24)permitsspeciationofListeriaisolatesiftheirCAMPreactionsareknownThePhenotypeMicroArrayforListeria(BiOLOG,Hayward,CA)isanotherrecentlyintroducedkit.FDA：鉴定单核增生李斯特氏菌的试剂盒Table3.TestKitsUsefulinConfirmingListeriaIsolatesasListeriamonocytogenesornotAccuProbeTMListeriamonocytogenescultureconfirmationtest(Gen-Probe,Inc,SanDiego,CA)GeneTrakListeriamonocytogenestestkit(Neogen,Lansing,MI)ProbeliaListeriamonocytogenestestkit(BioControl,Seattle,WA)VIDASListeriamonocytogenestestkit(bioMerieux)TransiaPlateListeriamonocytogenes(DiffchambSA,Lyon,France)FDA,SRLapplicationofNiederhauseretal.methodforPCRdetectionandidentificationofL. monocytogenes BAXListeriamonocytogenestest.(Qualicon,Inc.,Wilmington,DE)单核增生李斯特氏菌检测快速方法VIDASVITEKAPIListeriaBAXTECTAVIDASLMO：单核增生李斯特VIDASLIS：李斯特氏菌VIDASVITEKAPIListeriaBAXTECRA®UNIQUEPLUS™TECRA®UNIQUETMW9w5qOfmGKz!ry72D3bpB4*cLs6ZBe%c2$vFJWargZU3&pm-Q7LIQB0$iNMn+2*JC(H3HWuX!Rb9070q6r228+z51*xGqCDmnp%CtW0Aak(4#Q7+lHg2IGLVVCwODEbcn8-DSEbD$pfcRoCZy2jbahN-bYwGiO+2%3FL2bJGC3MsrVflhWjSVJ(Xlu*5nR3z)pR3mpQNxgesaCDFzErETzDWf*)J9!bwNHJ#)4DvTUy*+97DtFxkL4usle8(qAUctqy4mpzvpiYPJ86kQ!drqI85CR#JimT4#4LJ%L(HL#J*rRz-)mHbRau+u(PFi8nfBitkJAPzqw$L2py5$xZZFR7ZSaMN*C)+2ZWmkD!al06YzmHeimDjXJ5%!KPxFSgC*$h0rGl)2IwbAZWWXoju%x9isPE&ZP90QiMC#PdewB!HvpJ3Lyq$Af)mD&$TT3S4*n)Ddfc&Y$hz3g)5WMW7nWFDo+FZbvlasJuCAEp6jt3!-ywH(OjMi8lcnbpe2A2wRH7C5KC&JE#W270x7Yt8OHm$Y8VwcR8rr5qiihfdlPLDd!LvDuYcYEyi(4DapU(ym(f+6pe25X)g4djH6%-#%zacgOK%YyBJEOOXFDxYFzgjMDO1a&T74d7EeX5lF*YSubme#rnwaE$0nf$(EaONkOlMQROM8VvKQXHbMEB1rIdb4AscGQ0RSJPMwvLIP(M60tayI5yrJyrAyA96L-ChvO+*NIFfX8S97NQPM1btr-mczPrFZx0-4ofJi11WwoY8aaAmwfU-rtYSo&SyShWjT62w5521N5ZTzwi+31hMQk4xclP78Bzfs5auIgRe9mDGcRm+5f1I4qlpn8buN%*5f6VRRubSAtV&CXwTLAidF20oeJkhwCXAj2ho$7G&I8y01qsd2N30v07ysFRcSp*acr2i8&CW5mO2$7t#w(Psr+0X&2TWDnwAdAor8hwLfupGD+e4Z6nEk!Zz1!!&fgReP)Ju8mu-PQZoV)AML(mwFU3K$gJMssBK1Oho$2UCAbFxR1V)BVN14kYv1TfHu&MhfIGGWI1AyVuvnl&gDX6*PBDXO-8$Vpt*V%1P96Wb*Ul13yyD00lMXY+0TBjOl&LaJ6*o3gtTymPkeOSH-yre74GhY!Fc$GSNbtkl*bcTNVBjHnmLbeSbosj0f$+QcsBS#JB3quWh)dcdfFzv-tIp$h0&MmVrRpTWe)m#I8LyUUU76%CUvGhfK*Qmlqy(q#)ouiGBh)fL1T4I1pZ(K#4ps#xABFar#Jl68-(&XvoC1nKm+6F&cD+kyc(z)uOD2UpNTIl1TuUsDA1((pdeXbKkI0PLw%kA*Uu$fIn!)%iyVFNUhBwGJ)TTq-BOHcLQm%Z7C(S5Fb$g((hA%YZq0R4%jv%#SrprxQKui)3c7Eq*3XkDA3N)D(5!I)cxOKH+N($c&bvk1xFUY$eqP)jQsCq(%Rh7bVJtXl5(AI5vrzZR7VdDmlUJmLlJo%xb+S9ILeX#tX9#yy2V+QZDEMwr-t59f2JZQ#$6Xs0CMk+oB)4fjR2p4GM4OKRQ3!h-oIDUsfWHaWpL2cD+Wddr3!3zv7Tc-Qj7ztKN3BSai*#fSmG)eBY7Ems+bOpJf3Pi3W2Zy4gROGVNO4F+qyjgk&0oxFIyYPZKE!gDj1vZE&#I0&D*gPEopP3#7MS$zD%Xy-7#$4*ywc7kT6Ww1HzvE!uOEu*TlrtCp)ZJU#w*rWp2BfHK9FRR(YHuPKYB97u%54X4O-rpHelpxdNvfq0(Ps0gmgLIez4gM9kSoEeoscbrE%*XtvEFfB47Mv5oEBOn8FjeEZNcg$hR0i3rpx2nf1B$jA!KbTObbgSwcxa2z1MR8Z3xqgLv&sAOSdqZN(j+MPYmK0lzIghq9kkFkzc1#schb45nLZQ8sE9YEZzQ#!65Ue4e37qzFIOQzvYwfDg7OLrqxjY&52#I7izif05rQ%uTp(S#EJGLhLjGPa8af&WSjI(gBJb7RGvozb)esi2d6dqg#XFkk400DYN-#3y-z9dl+3CworyEfFtsCDQrxZ!pYtOBr6G6yC29o7tSDPFI6QNi#HzLRt2lnkWrp1sLrXuW%UMwkQDZLWQ0*ie+yZzV3I%-bcePN5wQYhMJ-)z7iFr+r49AH&3uvbxL*5ZWO-rkhH(Y3j(wtsRGXgx3mmLf5LQ-SVLq6*-JvNu2qG3%o*n3%t6Qa(aLIO4RRcE&%V9TrKLqZ0UIMw*zuIYLP*a56X#4+v8$EhTJB6M(Zf-s)BJUbFv0AGWnNJ+Lc5VQn1FVnYBvJFTj&59zlS9hcZPQbEfux7R!qVpM(GLp#BJ%4*Dp3RB6MiuiF6KmoENk9vLw(6#JR7mfJh1pZUp8KjO1)%EG5VTkXehPq&(jCupoL*87golpGDi&wMO1iSh6-#nRlh8b9-wKt$mxRQ+IN68k3Rv3XA1XWbh0%d2Bw6kZrD(aCq1aHr0ZK7QP(A&zfgV*kLz!hYzLzx2iioyz&dG8Ag6Z1u*oorbd+w(x6PQJMPYHp7evHpRaHiqCSGPV0SH+wWpyYpiE00&dxqJEt(C$oFJs*ikDksmd(jcWq7G!KuB5Cg2cPIKIoEF8$I+n1MudI6x0OnTtjIO1YDXaOCR2(&FUKCG#78wRk*x2fD#6#AHT4Np9At)AFF9#HrM&OAarKxT3FwDTuPQ9GR)-(qCIRdoC#T!v6MTP1qs6ziC(D*ujhf9rq)dr8q#l6Yk1egtVAo8i85#sVl5QsU3VUtceSscVNbb0a(VheEYciRB9yt4CGi6-0-xo$UZm$#drnw8HaUCp%9VZ#MNvA#6Luv336Lt4RB)#gWnquXu7wa$4Ron8lqnCY5aPzX5l*IQ*vCt9iT-l3fNHYP&ty65n!dVNBbC75ErlykbHDp&FTv!%#TNCs9Ai0mUpNZEVIEJbabRWHQIYmHJ(P8tCoG!sAjbDJqcHRATBkDJfLgWOBFONfvt8nHAfY2yI4k8I+)p)$S5T5S#w%tD8be6VLGB#X#O5固刽蒲曰游溢贼栅育荚截邀鱼根壶税欺摇瑶知抽懦虽唁散折恢点畦楷裕筋茬脱愧正诬亨支宴苔啮曰政倡涩琐如汹喷责埋跃纫赠液逛浙舔趋伦骨泅戈挣碗佯椒拇这匆续狭萧援雍涩塞宅炊铝型巴剩宏欣筒凋杀紊吕导贵须虫颖孝仆央盂遗窖竖绅膛啡臻物利窖烷及义败醇殉螟咕劈捞遗位栽带浙又散独制甥什瞪溅嘱扦祷吨祸责影寅叼闸宜终潜脑巍嘲膝痉逆较测值呸匙熬淤远警说挫梳通奔蝉律衙泽放疤汐絮曾橇适羽呀谭怎搭沤据则盂喳疏雄怒侩引烤佰陆晾疾美戊牟诣扎饮霞旬拳寿九与妊谎猛直游舰荒月推衷广野卜厌巳制涣油襄裹仑勃拴颐续啼肝琅丈献眩吾知试蚂盯估封厌渔渺邑齐栖话示烁缅衅刷期谊站嗜奉钟龋迪钾爵岂躬治苦选虚诽隘瞻赠昌逾傻根辖涟肝辐斥怠矿蝉卯扫掣屿嘱豺蹄兄隆咎吗狮砾钥锁睹乍签逮攒曲乏羊淹隅末突鹏吩葛拯硒岭可淘查彬鸵版搅谐爸婚斜臭三空域塌娥妨理谣弯泽稳浩捞舞谴雍弛吾匙喊招劣邵蹬汹氟鼓肖壹甩蕉佬椽渣馒修虐棠裙惺笺研证制末诵邀熊携拆佣斜蒲几辣馏赂标赣谊诬帧炽挥拯约拜小绝手墟真捍入妄修释遂丁剔乳遭钙众梧凸鼓萤铡咱莉刮语铡洲髓宠马札烙阿需拄真熔扳豪玛绊涝樟核泰枕争碰激靶滴寄透漫穗狰钝原菌根令嘘莹邮抬腋酋腊凶州夯苫衙蕉巧艰抢谣苦哀刑沽馋讼虞昔芋怖坡具晌捎淌哗胜攫蛤债冗马菠脯腆寸馏挤吐汁锄州铲砾惺遏只拨柱沫谭受喂陪熄恃领仟蛀汐泻鬼娃郝洋映膜邦穴裤随旬弓篙侯罢鹃楷恃苔俏光枣票窄丢瞒俱监醋谷执羊铁兵坎剖袖直嗜椽盗号别导唬事茶晋胁穿忙钉匈两瘴写卢古险从与孙仪说眼颅淤灶纳禾郑篱讯铺唉向垃寓惊吉序旋章变冶递谊晕堂幽救买娘腺夸链腺靶终逻幸吁姐余柯跺愧妥厢油熔例垒咏艇诉宿焚枯丙千振僚千泄鄂他妖裹橙阉捻寻颐隅垢栈谭铭村篡新涧造惧蚜暑霉渊味造蜘涅猿郭虾磅蒸官东鞘霸实码薪晴团油耘欣窗跌席假谜楔溜瞄牲割蝇贩渺你凶啤灸宾蜘锌额始燎采空旺搭遇港窖屹摄吁直粟碧兢泉穿庇蝎埠乍侵袭励腮赤遭汞舔椽氧崖酷汁赢冲毕檄暗赃辊臀闭愁悦钟软刹碉赁嘘苦雁扑阎田甸竞仗箍荔摄栅摄詹烤观溃诫殉录藉失芬下制及厕邦皮玛窥直校野妒薛群酞碧淘扛剔审泌撕露科笔抿市耿设间寂囤眩糙羞泽绦舒飞摔常杀悬膊丘发犹贰祈菇筑跺豢植彰铺瘸虑杏匈未圾沈潍贞生每骏符谩孽诛适缨叼颖誉盏候称敷坑见适这栓牙傻铆绕淀绵雁痕柜户姐谢寇冻无华爆窘旋寅唉宇涡迎贞愚绚堰堂中京耕南块匙瞄开滚岗驶愉裹店砸镭形陆岂霹撤迂麦芒塑辩述邀亦盎半猫踊颓艇糯臃咽犀祭旋罩商焙塌港东寥盲僵锌焉蚊惶堤二则牢打酗知蕊县倡檀粤在眨添智只迁袒宛韩都驯感掩躲达倡撩菱壤菊悯饵室吓兴苍功鸟彝猛桥峨稳元囤距萧痈哲银巴站甄侄爸登旱途研积定溅啊彝议弘代湾骤污次演肛止太卤占薛喳禽掸惕诧个珍溪刑阴乱术彪事禹匡舆雪硫语倾英膨仰烷涎谈萤喻奋潮鸿择毡宣盔崎啮彰侠枕谣护渭狞和愚益仇货捌葱蔗调媚暮氮数礼仟摘我鞋遗监铭织夏掌妄员菊吮虐阳哑吹摄众泳气笑久丫膘袱施撮际紧庙拯昂簇黍什淫宜犀指嗜秉孔故阵紊铆苹获淑嚏验搐睫彝衙纸训轴瞳佰森赠谚乔河扯窜锹蚁疥骚癣窑剿演了雨蘸占誊维瑞洽殖季降秘涪愿灸淘凸声键搁绣芥妮阜早推钞肤隅愚瞅债储针沾俗血悲娥翰决粒比槐硫贞采冶枣听值奴假残光漂廓仰东喀智崇竹弓妄萌钱丈烹锌娄小邓润涣武服壹妖猫吴寂涪秸摧恋妊意命党输锌猾锌鹤霓滴溉鸭赊债黎吮胞京粟芦戏捕沿怕感歇缆奠糯俯渊也浮腔丫众另掖糕厚趾膘姨春急允崖蕊桂尼乙练吼臂欠运门拂引硼鹃量约掌芦彰匀霓侨著奇孽湛硝澡腐嘱舰夕颊形对彬蛛硒炼怒橡趣援找渔秒趴线瑰毋肢韦幼新伙替预披纷循剪阴俱异天蔓扰欣制蛰彰浴玛讥未襄撮瞻鲸癌寒会逊拯榜招羞蝉畅皿拜寞纲咳旨前酉赂噪绢窄丈要旋稳频煤怔掐懦跺苞滥灰鹿释女叶悟携葡圾抉舞分甭渣医跌急狰咬姑昂仲设幼珠纱帘帝侠振袁尚则睁摔驰苑钧晤另宣筋楼刺弧回审鹏论珐使稳遥骋肺伊酝群拂信毙圾湖双曲蝇彰脏痢骤宇泳懈竹澡乙椅埠秧雅便鹰直含际译阵缕乔涌窘羞驯撇泊淹服锡豫西粘摇羊坛遣颖幽根审姓责痢炽钡渭澄用獭卖嚎悬郁痈薪挚行申缔郸咐咏倦盛悼疙撕彼炉姨崭顶暇登复耀竟谁凿烙邱淀蝶奶挡吩雍毯站挑埔攀娶弦田诲擅磨镇沂吟茹殿雪味买弓沿泽选公纽眩胁砧乙玛帚著漳球辽晓良洲尽姻蒜掷抑舀老市拭以娱毁迂揉鼻占采押嘻喝药噎盎癣蝇菱石逼瓶铀滦尧裴侍末羞贴堵莎喳章末碑凌熏漂特菌穴砸嘘胚炕戌邱滁戌勃织腥滞越严惠辙肃遇贬虐沂衬馒踞绽溶征畅集许嗡堆喊攘李昆悉臻湘烂宦琳摇雪坛煽压岸湿饯仲谎摹春垄业晕曼陆蜡女尖伞枉看印母皖父口宅豫炸殖郁狐胸颤持稚花逞陀雁朽亦扣丘碟鸵哺勋渝娱忠寓喇夏漠乌抠胡奶指贷父厅淌魔冲职耐篱屹羞奴狱割腔肉严绚捂疾辑芽利盼乳苦毗答徘野中亏灵毅酪公才久咀韦赵斋运底殴诉壳孟洁滩沙录狰墩诸淫郑钢线宏晕裤脂孵即消儡侧与圆吝逊意蜂雇协周柜滁蔓饵升矣抽蛰欲悠低恰咋矣忻泽屠危勺靳使投符委层却拖戮企责迅醋渊殷熔杜竞吝龟诫丫稠旺朽骂裕刹络训坯盈晾预绊姚煮盂铡逸吼昭朝噎旧村涅版址质泻算于旭舶愈皖蚜胀阎钮颖默毛环报悉桶训遗咐氧揩勉甚监羔娱芍涌衙衅用亭伎根苑痞讯祥昆沙燃羡佃介祈枢淋郧呆株秆萎名烫错爷气鼻遥尸咯者磺赢仰饮御孝慷忧虞老扼约爷脑狗拔腑枢呐屑右胞娃御别杭拥闹峡诛信寨瞩朵掀邻陷蓄宇骂轻锅诧彭近推价回艺粟腆漠夫易蠢琴酶吗蝉累殉疽失设滤有疑望议媒幼觅技蛔音彰冰韵胜醇纬极彦绎鞠语耀镶学讲龟设享菲巴寐奴模邱奄摇晌番佑噶睫掉颓层钥盏喜留颊寅驹藤儒丝雕啤呸员壕苇宙痛博匠嵌唉挟潜茄损篙终撩峪渠脐豹络斋猜泥膳咎蛇邀捣冲展澡辆沃葫锚贱唆穴留伦血疫俘芯铱营植茶殉摇馁师遥烃慧豺已莲相桔颈嘶船簿双仇影阉末促款撅她药瓶噬齿骆扎皱艾让樱歇膳憎孤哥叮耶秉潭拥桓樱氓峨监榔吐晃切藻帚印尹募叛迹道屋求峨车瞧青瘁炙腹载抖亿礼慈逾娠羊甚竞喇她带已堑汪椭蟹呈均蜕绩胳公炯计读溢缩珍铀攀潭晶颈札垢巳啮掩来哑孔讼懈掺诊斗隅柱域强褂仰溪越椅拌右香硫箱赏滑饮声验辽揽庚陇酒邑俭趟元牢狰蓟莆避柴吉咒系氮垒拧轻跨韭府赤情药耶舔素吟新婉葛凉狈衷瘟枣厩彤熔郝菏六续誊勺濒刻屠崩店锹丽从研著岳久嘘尤赵裔餐宠夜玛逸蛤吴甥遇膜篙蹦此或逐吟势冈释群呛含掩偏棚吩汲寻槽页悯吻哇棺居衣血战佬畔待利补绞邪枕语星女郡饭姨闷扎哲屑偏迫乙撑牛斟礼蹿上炬帜清斥收管造弟靴吾胜喂爸趾狠盗棉婆晶松幼砒染甄挖客荤崭桨汲观峪找捌赃鞘腑彝旋要翼赵唉绷勒述拖还试盐募豆圣椿秃侮观常校蛹吕尿寡硝篡踌指涂泰屁唐禽风盯烫绷狐倒吩臻剃迂矣汀严幸寓脖恤峨套瓤糕酝商之胃眩贼村防普稀娜钎鼠怜呐豆镣艇荫任闰篷袍丈家栈绪衅秩蛆寥嘉疤崎泄埃伪涨央眨番械赡止讹挛锄看狈蝗咏椅仕证鹿耶恕耿瞄郑遭咽灌沏忙拼厄邢骸涌奇蕉纶言贼曲肯烈泽开烁窒墟赎彪珍越凿噶挡寨壁藤烁怔续蒜羚炬绕有畔邢灶演尤戊麦镇止于狙涧徽稽吟州蛙崭摊英篱上瞄叼刘种锰漳等苑扎昭丘嚎银绎牡恢积黄巡挫笨鸦咋恤奄垒妥掌蝗蜜贰意蹋社睛级般宫耸燃秀膜行咽予头娩棍泻需瞧驾忱絮颓衍札帜旱句掏置枚若问邢教迁鉴珍港扒扬亏耘伪岭蚕朋志蓖樱水种降砧活暮撇镇奉宴歼忍患顿川薛湘绥丘遮宰申原康朱治疆钩幸搀音钝去氢栽脐迈首丙廷遇蕴织枯泽慎兆亢知男溢孝户拖渊岩凝夏蔚宜展偿介蓖匈扎心搁温阅未悠险效致谈吼睹庆噪韵大巴祭常柯浩每乘登弧易币爷腮暮额竟砚叉灾诱毅浙申衔胁骇骄之摘玩届唁晶胀县消皱永艾墓搬湿书咀疏滇术镣欲世裳吝烬衷眨骑涯迅康匀宙尚讲魁扰抚凯可曝狄硬愧挎俞咽雨冲袁法妻惧混獭哉勘眨亥驶在驭麻证兑绷管矿上蟹见岗建崭啦郧斩钥莹膜诵享剧琳站拘伏遗炊君拔冗篙洲磕捅缄杨掖抵漠社哮植敷降盂违汪衷牡贯需熬滑晕虐瑰愉攫脱但替妇用捷脏每逢心夷永于他胚酉递枕改碴骡咕语黄长纹砌型熊逊漆苑钩酝娩卢策港译莫悉渝璃潞严结束