文献文献第一章_利巴韦林[1]

前 言 第一章 抗病毒药物利巴韦林、EICAR的研究进展 1.1 引言 病毒性疾病是严重威胁人类健康的顽疾，其中艾滋病（获得性免疫缺陷综合症，Acquired Immunodeficiency Syndrome，简称AIDS）和丙型肝炎（HCV）是近年来新发现的传染病。据世界卫生组织估计，目前全球受艾滋病感染的人数已超过1000万。在我国健康人群中HCV感染率约占2.1％。寻找有效的抗病毒治疗试剂，一直是科学家们努力的方向。近年来随着人类对病毒生命周期的理解不断地加深，新的抗病毒治疗靶标不断被发现，抗病毒药物也已经由最初的几种发展到现在的几十种。 利巴韦林(1-(-D-呋喃核糖基-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺，Ribavirin，Virazole，Scheme1.1)和EICAR（5-乙炔基-1-(-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺，Scheme 1.1）是两种被证实了的具有广谱抗病毒活性的核苷化合物。它们对许多DNA和RNA病毒均有很好的抑制效果。尽管人们已经提出了许多可能的作用模式，但到目前为止，人们仍不清楚它们的作用机理。了解它们的作用机理对我们 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 、合成安全有效的抗病毒药物有重要的指导意义。本章我们将详细介绍利巴韦林、EICAR的抗病毒作用机理的研究现状。 Scheme 1.1 Ribavirin and EICAR 1.2 利巴韦林 利巴韦林 (Scheme1.1)是人们所合成的第一个广谱抗病毒药物。它对相当种类的DNA和RNA病毒均有显著抑制效果[1]。特别是对正黏病毒（如A型流感病毒和B型流感病毒(influenza A and B virus)），副黏病毒（如麻疹病毒(measles virus)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)），沙粒病毒（如拉萨热病毒(Lassa virus)）尤其有效[2]。近期作为急需药物，被应用于治疗非典型肺炎，并被证明在病毒感染初期具有非常积极的效果[3]。它也是目前应用于临床治疗丙型肝炎（HCV）病毒感染的唯一小分子药物[2a]。 利巴韦林的抗病毒活性可能和病毒复制过程中的一系列病毒蛋白酶（如病毒聚合物，次黄嘌呤脱氢酶，甲基转移酶等）有关。在细胞内，利巴韦林被细胞激酶代谢为相应的单磷酸核苷酸，二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸。这些磷酸化的核苷可能是其抗病毒的活性形式，它们可能破坏或抑制病毒复制过程中的各种酶，从而达到抗病毒的目的。 1.2.1 利巴韦林可能的抗病毒作用机理 自利巴韦林被发现以来，人们对其作用机理进行了不懈的研究。尽管至今其作用机理仍不清楚，但随着人们对其认识的加深，已经提出了许多合理的解释[7],[8]，这其中包括：抑制宿主细胞的次黄嘌呤脱氢酶；抑制病毒聚合酶；抑制病毒RNA的“髓盖”（caping）； 诱变病毒RNA基因；或调节宿主的免疫反应[4]。利巴韦林本身可能是一种可引发多种效果的药物，其本身或者由其诱发的效应都可能会起到抗病毒的作用。下面我们就对这些机理分别予以介绍。 1.2.1.1 抑制宿主次黄嘌呤脱氢酶 次黄嘌呤核苷脱氢酶（IMPDH， inosine-5’-phosphate-dehydrogenase）是生物体“从头合成”（de novo）鸟嘌呤核苷酸的决速酶。在NAD＋作为辅酶和钾离子激活下，IMPDH可催化次黄嘌呤核苷（IMP， inosine monophosphate）转化为黄嘌呤核苷（XMP, xanthine monophosphate），黄嘌呤核苷以谷氨酰胺为氨基供体，经氨基化生成鸟嘌呤核苷酸（GMP, guanine monophosphate , Scheme 1.2）。因而，IMPDH是抗病毒治疗的靶酶之一。 Scheme 1.2 Bio-synthesis of GMP from IMP via XMP 在利巴韦林的广谱抗病毒活性被报道不久，人们发现利巴韦林的单磷酸核苷（RMP, Ribavirin monophosphate）对次黄嘌呤核苷脱氢酶（IMPDH）有抑制作用[12]，它可导致细胞内GTP的浓度降低 [12-15]，而GTP是IMP转化为琥珀酰-AMP必不可少的因素, GTP浓度的降低也会间接影响ATP的合成 (Figure 1.1)。因为所有生物大分子的生物合成过程都需要GTP和ATP的参与，所以细胞内GTP和ATP浓度的降低将会降低病毒细胞的翻译，转录和/或复制的效率，从而影响病毒细胞的繁殖。因为翻译，复制和转录是所有RNA和DNA病毒繁殖所必不可少的过程，所以，这一机理可以很好的解释利巴韦林的广谱抗病毒性[16,17]。 Figure 1.1 Effect of inosine-5’-phosphate-dehydrogenase inhibitors on the accumulation of inosine monophosphate and depletion of GTP pools. 而这一机理在报道后不久，就遭到了质疑[15,18-20]，例如利巴韦林抑制某些病毒活性所需的浓度比其使GTP池浓度降低时要高得多[15]。有实验证明利巴韦林的抗病毒活性与病毒RNA基因的翻译或复制的效率根本没有联系[21]，所以利巴韦林对GTP浓度的影响，并不足以对生物大分子的合成产生严重的影响；并且，并非所有IMPDH的抑制剂都具有抗病毒活性[21-23]。很明显，利巴韦林抗病毒机理可能与IMPDH相关，但仅依此来解释其抗病毒机理还是很不够的。 1.2.1.2 抑制病毒聚合酶 利巴韦林的结构与天然核苷很类似，它可以作为胞嘧啶（Cytidine）和尿嘧啶（Uridine）的结合模板[21]（Scheme 1.3），并且它与胞嘧啶和尿嘧啶结合的几率是等同的。那么，在病毒转录过程中可能会被结合进遗传链，这样在病毒复制时，将改变病毒RNA的遗传密码，从而破坏病毒[24, 21]。 Scheme 1.3 The Pseudo base of ribavirin pairs equivalently with cytosine and uracil 利巴韦林进入细胞后，在细胞激酶的作用下，可转化为相应的单磷酸核苷酸（RMP，ribavirin monophosphate）和二磷酸核苷酸（RDP, ribavirin diphosphate），并最终转化为三磷酸核苷酸（RTP, ribavirin triphosphate）。RTP可在细胞内富集[25, 26]。RTP的抑制活性可能是通过利巴韦林在反复结合的循环过程中，直接与ATP和GTP的相互竞争来调节的。近来，在研究RTP与脊髓灰质炎病毒（Poliovirus, PV）聚合酶之间的相互作用时[27-29]，发现了直接与RNA相结合的利巴韦林，这提供了第一个利巴韦林与病毒RNA聚合酶直接相互作用的例子[21]。 1.2.1.3 利巴韦林作为病毒RNA的诱变剂 由于利巴韦林可以作为GTP或ATP的类似物与核苷相结合，由此人们提出了病毒唑作为PV基因的诱变剂的设想。鸟嘌呤核苷存在时，PV的复制需要碱基C突变为碱基U，而这种突变在自然PV中发生的几率是10-5[27]。如果利巴韦林是RNA病毒的诱变剂，那么在PV病毒生长期间，利巴韦林的存在，将会增加鸟嘌呤抗性变体出现的几率。事实确实如此，当病毒生长时增加利巴韦林的浓度，将导致鸟嘌呤抗性变体呈现剂量依赖的增长。证实了利巴韦林在细胞内具有诱变能力[21, 30-36]。 1.2.1.4 免疫调节 1.2.1.4.1 抗病毒细胞免疫 主体的免疫体系包括先天的成分（如单核细胞）及后天适应性组分（包括细胞的（T-细胞调节）和体液的（B-细胞调节）的影响）。T-细胞调节的适应性反应是主体抵抗细胞内病原体（如病毒）的多层防御体系的中心组分。功能性的T细胞包括CD4＋辅助细胞（Th）和CD8＋毒性淋巴细胞（CTL）。适应性的抗病毒免疫反应是由病毒专一性的T细胞反应（包括CD4＋和CD8＋ T细胞）的效应物作用来调节，同时，两种T细胞均分泌I-型细胞因子如IFN(和IFN(来对病毒感染作出反应，这些细胞因子补充新的杀死细胞和巨噬细胞到感染部位使其恢复正常功能。并且，一些I-型细胞因子如IFNr可以诱导非毒性机理，产生直接的细胞内抗病毒效果[37]。 辅助（CD4＋）T细胞在控制许多免疫反应、通过特有表面抗原、受体识别外源抗体方面扮演了重要角色。辅助T细胞的前体是一种已经接触抗原并分泌较少细胞因子的幼稚细胞，在合适的细胞因子和协同刺激（co-stimulatory）信号时，这些前体细胞分化成各种功能明确的子集，主要包括正则I-型(Th1)和正则II-型(Th2)辅助T细胞，每一类型单一的满足特定的免疫需要。早期辅助T细胞的细胞因子分泌模式是由T细胞固有机理决定的，它可通过治疗的改变来提高或减弱下游效应物的作用。 在细胞感染过程中，Th1细胞主要是用于建立细胞内抗病毒反应，而Th2细胞主要是诱导长期的体液反应，并且Th1和Th2细胞是相互消效作用的，这对调节主体的免疫反应十分重要。理论上，Th1细胞首先被活化用来清除病毒感染，然后Th2细胞进入调节和阻止“过度反应”（over-reactive）的Th1细胞，同时，Th2细胞引发体液反应，保护主体避免重新感染。所以，对病原体（如病毒）而言，一个给定的免疫反应，I-型和II-型免疫因子扮演有区别的但职责明确的调节作用。在分泌的时间、程度和T细胞的数量间存在一个平衡，如果该平衡被改变，使II-型提早，那么，I-型反应可能被抑制，细胞内环境有利于病毒的持久存在。事实上，许多病毒感染的慢性化发展与II-型T细胞的反应是相互联系的。 1.2.1.4.2 与病毒唑治疗相关的免疫调节 到目前为止，对HCV的发病机理的认识倾向于基于免疫过程，而不是直接的病毒毒性原因。在多数已清除HCV感染的病人身上可以观察到多种特定的T细胞反应[38, 39]。 某些免疫相关的疾病，其发病机理或慢性化要么与有害的II-型细胞因子响应有关，要么与I-型细胞因子响应的不足有关。数据显示宿主在感染慢性HCV时，其抗HCV响应可能具有类似的特性。首先，在急性HCV感染中II-型细胞因子的活化与HCV的慢性化发展相关[40]。同时，发现慢性HCV感染的病人含IL-4和IL-10的血清水平较高[41]。并且，对IFN(治疗有促进作用的临床反应与II-型细胞因子血清水平的降低有关。最后，当与IL-2表达质粒共免疫作用时，在鼠体内可以观察到对HCV核心蛋白的DNA疫苗免疫反应的提高，而与IL-4表达质粒共免疫化时则导致较差的抗病毒效应[42]。综合这些实例可以看出，若一种免疫调节试剂，能够使免疫反应偏向I-型细胞因子产物则对治疗有利。 最近，临床病例显示，与单独使用IFN(相比，利巴韦林与IFN(结合起来治疗慢性HCV感染可产生更多的持续的免疫应答[43]。单独的利巴韦林治疗中，对HCV或HBV病毒滴度显示其明显缺少抗病毒活性[44]。这也显示了利巴韦林临床作用的机理十分复杂，而并非仅仅抑制了病毒的产物。实行利巴韦林与IFN(的联合治疗的病人与仅仅实行IFN(治疗的病人相比，在治疗的过程中，对前者的应答与Th2向Th1细胞因子偏向有关。 有些间接证据表明，在对抗原的免疫反应中，利巴韦林可以通过改变I-型/II-型细胞因子偏向来进行免疫调节。首先，病毒唑在1-20 (M时，可以抑制II-型细胞因子调节的免疫反应（如体内抗体调节细胞毒性）[45]。第二，利巴韦林在治疗呼吸道合胞病毒时（RSV），不仅根除病毒，还出乎意料地减少了气管反应过度的发生（airway hyperreactivity），这种气管疾病与极化的II-型细胞因子响应有关。因而，利巴韦林的体内效应至少部分与I-型和II-型细胞因子响应的调节有关。 1.2.2 待解决的问题 1.2.2.1 机理的证实 以上我们概述了利巴韦林可能的抗病毒作用机理。尽管人们提出了各种假说，但至今为止，还没有明确的结果。它的作用模式是一个十分复杂的过程，可能是某种或某几种作用模式相互协作的结果。研究利巴韦林的作用机理以及发展其类似物作为更加高效低毒的药物，无论是对于基础研究, 还是对于新型抗病毒药物的开发，都有着重大意义和广阔的前景。为此，我们希望以光亲合标记方法识别出利巴韦林的作用靶标，进一步得到二者相互作用的具体数据，解析利巴韦林在靶标上的结合位点，澄清其作用机理。 1.2.2.2 开发新一代高效、无毒试剂 作为一种成熟的抗病毒药物，利巴韦林在抗病毒的临床实践中的应用和成功都是其他抗病毒药物无可比拟的。但同时，在大剂量使用时，它也有如引起贫血和畸形生长等副作用。我们希望在对利巴韦林作用机理研究的基础上，设计更加合理的抗病毒试剂。同时，合成利巴韦林的不同衍生物，研究其构效关系，以期得到更加高效、无毒副作用的新一代抗病毒试剂。 1.3 EICAR 1.3.1 EICAR可能的作用机理 EICAR的作用模式，与利巴韦林类似。研究表明，EICAR要显示其活性，首先也必须在腺苷激酶的作用下转变为EMP（EICAR monophosphate），然后再进一步磷酸化为EDP（EICAR diphosphate）和ETP（EICAR triphosphate）。EMP可作为IMPDH的竞争性抑制剂[46]，进一步研究发现EMP可惰化人类II型IMPDH和大肠杆菌的 IMPDH。此作用是分别通过对人类II型IMPDH的Cys-331和大肠杆菌的 IMPDH的Cys-305进行烷基化而实现的[47]，因而EMP应该也是IMPDH的半胱氨酸残基的烷基化试剂。 Minakawa, N.等[48]设计合成了[3H]-标记的EICAR [5-ethynyl-1- ([5’-3H] -1-(-D-ribofuranylimidazole-4-carboxamide]，用L1210细胞研究了其代谢作用，发现EAD可能和TAD一样，也可作为IMPDH的抑制剂[49]。 Scheme 1.4 EAD and TAD 总的来说，EICAR可能的作用模式可归纳如下[5a]（Scheme 1.5），首先，EICAR通过腺苷激酶首先转化为EMP，EMP不仅可以竞争性抑制IMPDH（path a），而且还可以与IMPDH形成EMP-IMPDH复合物（path c）。EMP还可转化为EAD，EAD作为NAD的类似物可以抑制IMPDH（path b）。这些结果的协同效应使EICAR通过抑制IMPDH从而有力地抑制了IMP转化为XMP，进而使GTP的合成显著减少。同时，EMP在细胞激酶的作用下，进一步磷酸化为ETP，ETP作为GTP的类似物可替代GTP，抑制病毒的增殖和生长所必需的RNA聚合酶，鸟苷转移酶，N7-甲基转移酶等，从而达到抑制病毒生长的目的。 Scheme 1.5 Proposed mode of action of EICAR 1.3.2 待解决的问题 同利巴韦林一样，人们也不清楚EICAR的作用机理。对其作用机理的澄清，无疑有助于我们深入了解其作用模式，帮助我们设计和开发高效、无毒的新一代抗病毒试剂。 1.4 结语 以上我们概述了利巴韦林和EICAR可能的抗病毒作用机理。它们的作用模式是一个十分复杂的过程。我们希望以光亲合标记的方法来研究利巴韦林和EICAR的抗病毒作用机理，并在此基础上，开发出新一代高效、无毒的利巴韦林和EICAR的衍生物作为抗病毒治疗试剂。因此, 本 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 主要描述了我在设计，合成和表征利巴韦林和EICAR的光敏探针， 以及合成新一代利巴韦林和EICAR衍生物这两个方面的工作。 参 考 文 献 [1]. 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