分离课件第4章 提取的基本理论 2005.06

第4章 生化活性物质提取技术 1、 生化活性物质提取技术概述 提取是指目标生化活性物质与细胞固体成分或其他结合成分的分离，由固相转入液相或由细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程。有固液提取和液液提取两种形式。 固液提取是指被提取物在胞内呈固相或与固体结合存在,提取时由固相转入液相的过程,多指初级分离阶段。如：中草药有效成分的水煮、醇提，海藻中多糖的水提醇沉等。 液液提取是指被提取物原来呈液相存在,提取时由某一液相转入另一互不相溶的液相过程，多贯穿于整个分离纯化过程。如：石油醚萃取果蔬粗提液的叶绿素,热苯萃取发酵液中扁桃酸等。 2、 提取的原理和策略 提取的原理主要是根据不同物质在不同溶剂中溶解度的差异，达到目标生化活性物质与杂质的分离。 溶解度的差异用于分离制备有两个主要目的或策略: ①选择一个对目标生化活性物质溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂，使目标生化活性物质从混合组分中选择性地被分离出来。如：酵母醇脱氢酶的热变性提取，就是基于醇脱氢酶的热稳定性较高，而杂蛋白的热稳定性较低的特性，采用55℃高温去除热变性杂蛋白、而醇脱氢酶多处于上清液中的方法。 ②选择一个对目标生化活性物质溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂，使目标生化活性物质沉淀或结晶析出。如：利用啤酒酵母泥提取脱氧核糖核酸（DNA）就是基于RNA的PI = 2.0～2.5，而DNA的PI = 4.2的特点，以及当提取体系中NaCl浓度为0.14 mol/L和1 mol/L时，DNA的溶解液分别为NaCl浓度为0.5 mol/L时的11%和200%，而RNA的溶解度变化不大的特点。通常可采用在pH = 2.0的1 mol/L NaCl体系进行粗提，然后调整体系pH = 4.0～4.5且NaCl浓度为0.14 mol/L进行PI沉淀。 3、 提取的基本原则 通常，提取的原则主要包括如下四方面： ①极性原则，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； ②酸碱性原则，碱性物质易溶于酸性物质，酸物质易溶于碱性物质； ③温度效应原则，一般地温度升高则溶解度升高； ④pH原则，pH值远离生化活性物质的等电点则溶解度升高。 4、 提取的主要影响因素 在实际操作中，影响提取的主要因素有三个：被提取物在提取溶剂中溶解度的大小，被提取物由固相扩散到液相的难易程度和被提取物在不同溶剂中的分配效应。 1.溶解度大小的影响： 生化活性物质溶解度大小主要与物质的自身分子结构，如基团的亲水平衡值基团的排列和偶极距等内因有关，外部影响因素主要是指所用溶剂如水、有机溶剂、稀盐缓冲液等理化性质、提取过程的温度、提取体系的pH值和离子强度等。尤其要注意的是，对特定的生化活性物质而言，一种物质溶解度的大小与溶质和溶剂的性质息息相关，是溶质-溶质，溶质-溶剂，溶剂-溶剂三个相互作用力综合平衡的结果，在此，相互作用力主要有：偶极-偶极相互作用，偶极-诱导偶极相互作用，弥散力，氢键，离子基团的静电作用等。外部因素更多时候是通过该种综合平衡来实现对溶解度大小的影响。 2．固液萃取中扩散难易的影响： 被提取物由固相扩散到液相的难易程度主要遵从Fick扩散第一方程式： dM = D ( F ( dC/(dX ( t)， 其中D = k ( T/(µ ( M) 式中：dM-已扩散的物质量；D-扩散系数；F-扩散面积；dc-两相界面浓度差，为扩散过程的推动力；dx-溶质扩散的距离；t-提取时间；T-提取温度；µ-粘度；M-分子量；k-校正因子。 扩散的影响因素及其应用: 1) 升温有助于扩散量dM的提高，但对生物大分子而言，升温是有一定限度的，否则将破坏其生理活性 2) 粘度下降则扩散系数上升，导致扩散量dM的提高如：提取蛋白质或酶时，加入核酸酶破坏大分子核酸或加入鱼精蛋白硫酸链霉素沉淀核酸，可使溶液粘度下降，dM提高 3) 搅拌使已扩散的溶质迅速与溶剂混合，能保持两相界面的最大浓度差, 则扩散系数上升 4) 提高细胞破碎程度, 则扩散面积F提高，dx下降，有助于扩散量dM 的提高。 5) 延长提取时间t，则dM上升 6) 采用分次提取有助于提高dC，从而扩散量dM大为提高。Xn=[K*W/(K*W+L)]n 这点与分批洗涤过滤类似 ①中成药胃得安有效成分胎盘活性蛋白因子的提取：将人或动物胎盘破碎至一定程度，过16～30目筛，取胎盘颗粒于水提系统中，加入10倍量水，加入适量核酸酶，100 rpm搅拌下，采用文火加热的方式提取2 h，其间换水2～3次。 ②酵母异柠檬酸脱氢酶的提取：取微生物发酵液的新鲜面包酵母泥100 g，加入20 ml 0.1 mol/L NaHCO3溶液和适量的玻璃砂，于研钵中，冰浴下反复研磨，2000 rpm离心10 min后收集上清液，加入pH 7.4 30 mmol/L TrisHCl缓冲液配制的异柠檬酸，于37℃恒温水浴10 min后，340 nm测定酶活。 ③酵母RNA的提取：通常采用0.14 mol/L NaCl溶液将组织匀浆后反复提取细胞质的核糖核蛋白，而留下含有DNA的细胞核物质。然后用10％ HAc调pH 4.2沉淀，离心弃去上清液，先用0.5 mol/L NaCl，后用水洗涤沉淀，保持核糖核蛋白后溶解于0.5 mol/L NaHCO3溶液中，离心，取上清液，调pH 4.2，沉淀用0.5 mol/L NaCl洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中蛋白质可用少量辛醇－氯仿溶液抽提去除，核核酸留在NaHCO3水溶液中，加入乙醇，RNA即以钠盐形式沉淀出来 3.分配定率 在应用有机溶剂提取中，由于存在着物质在两个互不相溶的液相中能够由于存在着物质在两个互不相溶的液相中浓度分配问题，此时物质分离主要有分配定律起作用。 在恒温，恒压状态下的稀溶液， (C1/C2)=K C1：分配达到平衡后溶质在上层有机相中的浓度 C2：分配达到平衡后溶质在下水相中的浓度 K：分配系数 注：1、不同溶质在不同溶剂中的K值不同 2、混合物中各组分K值彼此接近时，分离较困难，只能在不断更新的溶剂中反复抽提才能分开 3、在生物大分子的制备中，分配定律的应用常与溶解度的影响因素结合加以运用。如：乙醇沉淀血浆蛋白 5、 蛋白质和酶的提取 1．蛋白质的分类： 按功能分：活性蛋白与非活性蛋白 · 活性蛋白：酶、激素蛋白、运输和贮存蛋白、运动蛋白、防御蛋白、病毒衣壳蛋白、受体蛋白、毒蛋白和控制生长与分化的蛋白 · 非活性蛋白：胶原蛋白，角蛋白 按结构和溶解度分：见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 4-1 从上表可以看出大部分蛋白质可溶于稀盐,稀碱,水,有机溶剂中.因而可用不同的溶剂提取,分离纯化蛋白质和酶.蛋白质和酶在不同溶剂中的溶解反应差异主要取决于:分子结构性质和溶剂理化性质(T,PH,I等) 2．蛋白质的性质： ⑴蛋白质的两性解离和等电点：（用于提取PH选择或PI沉淀） 蛋白质和氨基酸一样，既含有酸性的基团又含有碱性的基团，在特定的PH范围内能解离产生带正电荷或带负电荷的基团。 对于某一特定蛋白质来说，当在某一PH时，其所带电荷正负相等（及静电荷为0），这一PH值被称为蛋白质的等电点。 蛋白质处于等电点时具有一些特殊的性质，此时不仅是蛋白质的阴阳离子向相反的方向转化的转折点。而且在此特定条件下，其电导率，渗透压，粘度及溶解度等性质均处于最低值，因此我们通常采用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。 注意：等电点随溶剂性质，离子强度等因素而改变，中性盐的存在可以明显地改变蛋白质的等电点。 ⑵蛋白质的胶体性质：（用于透析、浓缩、电泳、层析） 凡质点大小在1-100nm范围内所构成的分散系统称为胶体，蛋白质分子的直径一般在2-20nm范围内，且蛋白质分子表面分布着亲水氨基酸的极性R基。通常与水分子结合着，故蛋白质溶液是一种亲水基团。 蛋白质溶液具有丁达尔效应，布朗运动，膜半透性和电泳现象等性质。而后两个性质常用于蛋白质的分离、提取、测定中。 ⑶蛋白质的沉淀作用：（用于沉淀分离、结合PH） 天然蛋白质溶液保持稳定的亲水胶体性质，其稳定性取决于：水化作用（水化膜的存在，能防止蛋白质分子相互碰撞而聚集）和电荷的排斥作用（两性解离，同性电荷相互排斥而使蛋白质无法聚集）。 当改变蛋白质的质点大小，电荷情况和水化作用的强弱，将破坏蛋白质的稳定性，蛋白质就从溶液中沉淀出来，这就是蛋白质的沉淀作用（precipitation） 因此，我们在生物大分子的分离纯化中，常利用蛋白质的沉淀作用来分离和制备蛋白质和酶。如采用等电点沉淀法分离牛奶酪蛋白。 ⑷蛋白质的变性作用：（可用于选择性变性沉淀除杂质） 当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响后，由氢键，盐键等次极键维系的高极结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使其生物学性质，物理化学性质改变。这种现象称为蛋白质的变性作用（denaturation） 蛋白质的变性作用的影响因素包括： 1) 物理因素：加热，紫外线，X射线，超声波处理 2) 化学因素：强酸，强碱，尿素，乙醇，TCA 变性特点： 变性蛋白质的理化性质均发生改变，最显著的是溶解度溶解度降低，粘度增大，分子扩散速度增大，渗透压降低，等电点改变，生物活性降低或丧失，易被酶水解等。 因此我们在制备酶制剂或具生物活性物质使防止蛋白质变性的发生。 变性原因： 由于分子内部的结构发生改变所致。变性后，分子内部的氢键被破坏，蛋白质分子就从原来有秩序的紧密结构变为无秩序的松散结构，即蛋白质的变性是由于二级以上的空间结构发生改变或被破坏所致。变性作用并未引起一级结构的破坏（即肽键不被破坏）。因此变性后的蛋白质在结构上虽然有改变，但其组份及分子量没有改变。 ⑸蛋白质的颜色反应： 蛋白质分子中存在某些特殊的氨基酸，他们可与多种化合物作用产生各种颜色反应，这些颜色反应可作为蛋白质的定性定量测定。 重要的颜色反应如： · 双缩脲反应， · 米伦反应 · 黄色反应 · 乙醛酸反应 · 茚三酮反应 · 酚试剂反应 · 萘酚-次氯酸盐反应 3、蛋白质的提取方法： （1）、水溶液提取，如表示： （2）、有机溶剂提取：如表示： （3）、从细胞膜上提取水融性蛋白质和酶 · 膜上蛋白质和酶的存在状态： a) 在膜面上与膜成分联系疏松 b) 为膜的成分之一，或与膜成分紧密结合 · 提取方法 a) 对结合较松的经充分破碎细胞，在一定PH范围的稀盐溶液中提取： 如：线粒体上的细胞色素C，采用PH＝4的盐酸或等渗NaCl液 b) 对结合较牢的可以采用化学处理： · 浓盐或尿素提取：2M浓度即抽取>=27％的膜蛋白，但易变性 · 碱溶液：PH＝11 约抽取40～50％的膜蛋白 · 金属螯合剂：EDTA可使蛋白质释放出来，因为蛋白质以金属离子与膜成分结合 · 有机溶剂：使用乙醇、吡啶、正丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮制成丙酮粉，是提取脂蛋白及其组分最常用方法之一。 如：碱性脂酶 · 去垢剂处理： 1) 弱离子：脱氧胆酸盐、胆酸盐、 溶解性小、温和性好 2) 强离子：SDS 溶解性好，温和性差 3) 非离子：Triton x-100、Tween 溶解性小，温和性好 该法目前广泛用于膜上水溶性蛋白和脂蛋白的提取，通常溶度为1％，选择时考虑去垢剂的溶剂能力和温和性. 酶水解蛋白的脂蛋白：加入酯酶或磷酸酯酶。 如：细胞色素C 也可以用超声波振荡 6、 核酸的提取： 1．分类： RNA：A，G，C，U，磷酸，核糖 DNA：A，G，C，T，磷酸，脱氧核糖 2．核酸的性质： ⑴溶解性： DNA和RNA均是极性化合物，一般地，它们均微溶于水而不溶于乙醇等有机溶剂，但它们的钠盐比自由酸易溶于水。 DNA和RNA在生物细胞内大多数与蛋白质结合成核蛋白，其溶解度的影响因素有： 溶液的盐浓度： DNA蛋白的溶解度在低溶度盐溶液中随盐浓度的增加而增加。在1M NaCl溶液中溶解度比在纯水中高2倍，而在0.14M的NaCl溶液中溶解度最小，仅为纯水中的1％。 RNA蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在在0.14M的NaCl溶液中溶解度较大。 因此，在核酸的提取中，常用改变盐浓度的方法分别提取这两种核蛋白，然后再用蛋白变性剂（如十二烷基硫酸钠）去除蛋白质。 PH值: DNA PI=4.2 RNA PI=2.0-2.5 因此,在核酸的分离和制备时,可用调节溶液的PH值,使二者达到分离的目的. ⑵核酸及其组分的两性性质: 核酸和核苷酸既有磷酸基(呈酸性),又有氮碱基(呈碱性),属两性电解质. 核酸分子种磷酸残基解离的pKa`较低，而且具有多价解离性，故当溶液的PH值高于4时，核酸分子几乎全部解离，呈多阴离子状态。因此，可把核酸视为较强酸性的多元酸。多阴离子状态的核酸即可与金属离子结合成盐，也可与碱性蛋白质（如组蛋白）结合。 溶液的PH值直接影响核酸双螺旋结构中碱基对之间氢键的稳定性。对DNA、碱基对在PH＝6～11最稳定。 ⑶核酸的等电点: 核酸大分子是多级解离，pKa`值较低，约为1.5，故等电点较低。一般地，RNA地PI约为PH 2～2.5时DNA的PI值约为PH 4～4.5。 ⑷紫外吸收:（用于核酸定性、定量测定） 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，尤其是对240-280nm紫外线有强烈的吸收能力.一般地，λmax=260nm。 紫外线吸收光谱与分子中可解离基团的解离状态，PH、光波波长等因素有关。一定组分具有特征的λmax、λmin，因而具有特定的消光系数（εmax、εmin）,这些数据即作为核酸及其组分定性定量测定的依据。 核酸吸收紫外线的强度的表示方法有： · 光密度OD：利用紫外分光光度计测定各波长下的OD值 · 克原子磷消光系数(：每升含一克磷原子的核酸浓度（PH=7）的ε值。 λ＝260nm时，天然RNA的ε＝7000～10000， 而DNA的ε＝6000～8000 核酸紫外吸收的性质常用作核酸组分含量的测定。在某PH值下测样品的O.D值，再根据下表查出测定波长的克分子消光系数（ε），即可由下式计算样品中核苷酸的含量。 在固定PH的条件下：C=M*O.D/ε/l； 式中 C:核苷酸的含量；M：核苷酸的分子量；O.D：紫外吸收光密度；ε：克分子消光系数；l：光程（即比色皿内径厚度，cm） ⑸核酸的变性和复性： a.变性:核酸与旦白性一样,分子均具有一定空间构象,维持这种空间构象的主要是氢键和碱基堆积力. 某些理化因素会破坏氢键和碱基堆积力,使核酸分子的高级结构改变,从而引起核酸理化性质及生物学功能改变,这种变化称为变性(denaturation). b.变性的影响因素: 外部因素:加热,过高过低PH，有机溶剂，尿素，酰胺 等。 内部因素：核酸分子本身结构，如分子中G，C含量高，分子就稳定,不变性，因为形成三个氢键。 C．变性特点： 核酸变性后，粘度下降，某些颜色反应加强，生物学功能改变，紫外线吸收增加。如天然DNA完全变性后，入260 nm吸收能力增强25-40%,RNA变性后约增加1.1%. 这种由于核酸变性(或降解)而引起对紫外线吸收增加的现象称为增色效应或高色效应(hyperchoromicity). d.复性: 某些变性是可逆的,在一定条件下,变性DNA(单链)又可以相互结合成双链,该过程称复性(renaturation).复性后,紫外线吸收减少,称为减色效应(hypochoromicity). e.通常用加热的方法来研究核酸的变性过程.加热后的DNA溶液若缓慢冷却至室温,变性后的DNA可以恢复其原有的理化性质,若加热后迅速冷却,则变性的DNA不能重新组合成双螺旋,属不可逆变性. 3、核酸的提取：（以溶解性为依据） 1) RNP核DNP的分离 a) 常用0.14M NaCl溶液提取RNP，此时DNP的溶解度极少，而RNP的溶解度依然很大，因此二者得以分离（RNP的溶解度基本稳定） b) 提取DNP则用1M NaCl溶液，使其达到最大提取效果（DNP的溶解度随NaCl溶度增大而增大） c) 两种蛋白的溶解度和PH值有关，DNP蛋白在PH4.2时，溶解度最低，而RNP蛋白在PH2.0～2.5时最低 2) RNA的提取 a) RNA的分类： Ⅰ、r RNA：从核糖体中提取 Ⅱ、t RNA：从细胞质中提取 Ⅲ、m RNA：从多聚核糖体中提取 b) RNA的提取方法： 胞内的三种RNA随不同的细胞位置而异，常将组织进行差速离心，分别制得细胞核、叶绿体、线粒体等细胞器或细胞质后，分别从中提取某一类RNA。 c) 实例： Ⅰ、植物中RNA的提取分离 Ⅱ、大肠杆菌中t RNA的提取分离 Ⅲ、T4感染的大肠杆菌中RNA的提取 Ⅳ、动物肝脏中r RNA的提取分离 d)、核酸提取中杂蛋白的去除： Ⅰ、用氯仿－辛醇混合液振荡，使蛋白质变性，于氯仿－水的界层形成凝胶而得以去除 Ⅱ、用冷的2M盐酸胍溶液溶解大部分的蛋白质，使RNA沉淀而去除。 Ⅲ、用SDS使蛋白质变性，发生沉淀而去除 Ⅳ、用光谱蛋白酶分解蛋白质而去除 Ⅴ、用含水苯酚液和组织匀浆一起振荡，使变性的蛋白质及DNP处于下层酚相或两相界层处，而RNA处于水相 3) DNA的提取： Ⅰ、含水苯酚法：DNP和杂蛋白处于下层酚相中，而RNA于水相 Ⅱ、1M NaCl法：1M NaCl溶液提取DNP溶液，然后与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡，去除蛋白质 Ⅲ、0.14M NaCl法：（或0.1M NaCl＋0.05M柠檬酸）用0.14M NaCl反复洗涤匀浆除去RNP，再用1M NaCl抽提DNP，用氯仿－辛醇去除蛋白质 7、 包含体的破碎与提取 外源基因在微生物宿主中表达能产生重组蛋白，当重组蛋白高度表达时，将导致在细胞中形成包含体。一般地，包含体在透视性相差显微镜下为不透明的颗粒，直径可达0.1～3.0 µm，性质稳定，难溶于水，仅在变性剂溶液中才能溶解，而且密度较大，有折光性。 基因工程产物形成包含体的原因很复杂，可理解为外源蛋白在新的环境中，由于外界条件变化而引起折叠错误的结果，与所用的系统和蛋白质的种类无关，与蛋白质的内在性质也无直接关系。 由于包含体是在翻译的后阶段蛋白形成时折叠发生错误的产物，虽然具有正确的一级结构，但高级结构出现错误，所以不具有生物活性。必须通过洗涤、变性和复性才能体现目标蛋白质的天然结构和活性。 目标蛋白质凝聚形成包含体后，由于密度较大，易于离心分离，而且能减轻蛋白酶对其的降解作用和其对宿主细胞的毒害作用。但是，包含体的形成为重组蛋白的分离纯化带来很大的困难，常因重组蛋白的变性和复性效率不高，而使目标蛋白的活性和回收率很低。通常包含体中目标蛋白含量很高，有时可占细胞总蛋白的50％以上。 包含体中目标蛋白的制备，包括细胞破碎、包含体的沉淀、包含体的变性溶解和蛋白质的复性等步骤。细胞的破碎常用水解处理和高压破碎方法，细胞破碎后，采用低速离心沉淀包含体，用表面活性剂洗涤去除脂类和膜蛋白，然后用高浓度的变性剂（如6 mol/L盐酸胍或8 mol/L脲）溶解包含体，在变性剂溶液中溶解的蛋白质呈变性状态，但一级结构和共价键未被破坏，去除变性剂后，蛋白质可复性成正确构型。 蛋白质的复性操作主要有两种方法：（1）将溶液稀释，降低变性剂的浓度和降低蛋白质的浓度，使蛋白质复性。该法的缺点是增大了后处理体积。（2）利用透析、超滤等膜分离技术去除变性剂。该法适用于较高浓度的蛋白质复性。复性的效果取决于蛋白质聚集和正确折叠之间的竞争。为了减轻聚集，复性通常在低浓度（10～100 µg/ml）下进行。 目前，提高目标蛋白质复性效率的对策主要有：（1）加入聚乙二醇等共溶剂，可逆修饰折叠中间体的疏水表面；（2）加入二硫苏糖醇等巯基还原剂，重建二硫键；（3）加入二硫键异构酶与脯氨酸顺反异构体酶，提高重组蛋白质的正确折叠率；（4）添加分子伴侣，提高折叠中间体的缓冲体系，防止肽键的错误折叠；（5）利用疏水作用色谱，离子交换色谱，金属鳌合色谱和凝胶过滤色谱等进行色谱复性。 8、 中药有效成分的提取、分离与纯化 植物体内的成分是由复杂的化学成分所组成，其中有药用价值的是生物碱、萜类、甾体、苷类、黄酮体、蒽醌、香豆素、有机酸、氨基酸、单糖、低聚糖、多糖、蛋白质、酶及鞣质等。而纤维素、叶绿素、蜡、油脂、树脂和树胶等是具有经济价值的成分，在研究植物生理活性成分时作为杂质除去。 1.有机溶剂提取法 有机溶剂提取常采用回流提取法、索氏提取法、浸渍法和渗漉法。可采用几种极性不同的溶剂，由低极性到高极性分步提取，使各成分以其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。也可采用单一溶剂提取。因乙醇溶解性能好，对植物细胞的穿透能力强，单一提取的常用溶剂为不同浓度的乙醇，浓度根据被提取物质的性质而定。 2.水提取法 水提取可分为水煎、水浸和水渗漉三种，也可用酸水或碱水提取。碱性、酸性或苷类化合物，如小檗碱、甘草酸、芸香苷等，较溶于水，可选用水为提取溶剂。但是用水提取时，提取液中杂质较多（如无机盐、蛋白质、糖和淀粉等），不利于进一步分离。因此，有些化合物虽能溶于水，但为了使杂质尽量少带出来，也常常用有机溶剂提取。 3.水蒸气蒸馏法 挥发油和某些挥发性成分能用水蒸气蒸馏得到。如麻黄碱就可以用水蒸气蒸馏法从麻黄中直接蒸馏出来。 4.液-液萃取法 通常所指的萃取，即液－液分配萃取，是利用混合物中的各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。当提取溶剂选用的是水或醇水溶液时，提取后浓缩成浓缩水液，选择合适的有机溶剂与其萃取。若所需成分是脂溶性，可用有机溶剂如石油醚、氯仿或乙醚；若所需成分是亲水性物质，用弱亲脂性溶剂如正丁醇等进行萃取。 5．酸碱法 如果要分离成分是酸性或碱性化合物，常可向提取溶剂中加适当的碱或酸，使其成盐，而再加入适当的酸或碱，则可恢复原来的游离状态。这些化合物的盐类水溶性较大，其相应的游离状态酯溶性较大。利用酸碱处理使生成物的溶解性改变，再加以两相萃取，则可分离酸性或碱性的天然化合物。 6.沉淀法 酸性和碱性的化合物，可以通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类沉淀析出，如酸性化合物可做成钙盐、钡盐、铅盐等，碱性化合物可做成苦味酸盐、磷钼酸盐、磷钨酸盐、雷氏盐等。用过滤法分离沉淀，再使用适当的方法对沉淀进行复分解而得到原来的酸性或碱性化合物。 7液相层析法 液相层析（LC）分离纯化法包括制备薄层层析（PTLC）、离心薄层层析和柱层析（CC）等。层析用分离介质有硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺、葡聚糖凝胶、活性炭等，有正相层析和反相层析之分。柱层析可按压力大小分为常压柱层析、低压柱层析、中压柱层析和高压柱层析。 8重结晶 固体天然化合物达到一定的纯度，可呈结晶状，用过滤法可以使结晶和母液分开，达到进一步分离纯化的目的。常用混合溶剂法进行重结晶操作，即将粗晶溶于少量第一溶剂（使结晶易溶解的溶剂）中，然后加入恰好使溶液变成轻微混浊状所需要的第二溶剂，静置析晶，过滤收集晶体。若结晶的纯度还不够，可进行第二次重结晶或反复重结晶，以得到高纯度的天然化合物结晶。 9、 天然动物药物的制备 1．天然动物药物概述 天然动物药物与天然植物药物和化学合成药物一样，也是人类防病、治病的重要药源，在人类历史上占有举足轻重的地位。最初，天然动物药物大多数来自动物脏器，俗称脏器药物。其原料来源主要是家畜、家禽的组织、器官、血液和毛发等；如：①从动物大脑可制备脑磷脂、卵磷脂、胆固醇、褪黑激素和催眠多肽等；②从动物心脏可提取细胞色素C、心脏激素、辅酶Q10、辅酶A和辅酶I等；③从动物肝脏可分离过氧化氢酶、肝解毒素和超氧化物歧化酶等；④从动物胃肠及粘膜可制备胃蛋白酶、胃肠道激素、凝乳酶和肝素等；⑤从动物骨可提取蛋白胨、硫酸软骨素；⑥从动物毛发可生产各种氨基酸；⑦从动物血液可制备水解蛋白、纤溶酶、凝血酶、血红素、超氧化物歧化酶等；⑧从动物胆汁可获得人工牛黄及其各种制剂、胆酸系列衍生物等；⑨从人尿可制备尿激酶、绒毛膜激素、抑胃素等。现在，由于制药科学的发展，天然动物药物的原料来源已不仅仅局限于动物脏器，但脏器来源的药物在目前的临床用药中仍占重要的地位和相当的比例。 中国早在公元6世纪就开始使用羚羊角治中风、用胎盘作强壮剂、用鸡内金止遗尿和消食健胃。20世纪20至80年代是天然动物药物的鼎盛时期，在这一时期，由于人类对动物脏器的有效成分的逐步明确及其防病、治病机理的了解，促进了天然动物药物的发展。20世纪90年代以后，由于现代生物技术，尤其是微生物发酵技术和基因工程技术的迅速发展，某些天然动物药物，如：药用的蛋白质、酶和氨基酸等产品，从原有的以动物组织或器官为主要来源通过分离、提取制备，转为微生物发酵产品或基因工程产品。 由于从脏器中提取天然动物药物的成本高、产量低和存在免疫抗原性等问题，已经远远无法满足日益增长的临床需要。因此，近二十年来，大规模动物细胞培养技术和转基因家畜乳腺生物反应器技术逐渐成为某些动物药物的新兴制备技术，采用这些高新技术，不但能获得天然来源难以得到的内源生物活性物质，达到某些动物药物的批量生产，解决提取原料的不足和免疫抗原性的局限性，而且能通过构效关系研究开发出新的生物活性物质，提高其药用价值，扩大动物药物的来源。现在，某些活性蛋白，如：乳铁蛋白、α-抗胰蛋白酶、纤溶酶原活性因子、活性蛋白C、血纤蛋白、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、人血清白蛋白和促红细胞生成素等，已能成功地在转基因牛、羊或猪等哺乳类动物乳腺中进行表达，然后从乳液中进行分离制备。 按照药物的化学本质和结构进行分类，天然动物药物可划分为以下几大类：① 氨基酸类药物：包括天然氨基酸及其衍生物。② 活性多肽类药物：主要有天然多肽类激素和人工合成活性多肽。③ 蛋白质类药物：包括蛋白质激素、天然蛋白质、蛋白质类制品、结合蛋白质、粘性糖蛋白、血浆糖蛋白及其它糖蛋白等。④ 酶类药物：包括消化酶、抗炎酶、循环酶、抗癌酶等水解酶。⑤ 核酸类药物：主要包括核酸碱基及其衍生物、腺苷及其衍生物、核苷酸及其衍生物和多核苷酸等。⑥ 糖类药物：主要包括单糖、低聚糖、多糖和糖的衍生物。⑦ 脂类药物：主要包括不饱和脂肪酸、磷脂、前列腺素以及胆酸类等。 天然动物药物的制备方法主要有：提取法、发酵法、化学合成法、组织培养法和基因工程技术法等。其中前三种是现阶段最常用的方法，而提取法则是最基本的，因为不管哪一种方法都包含着提取的工艺过程。 提取法指用溶剂从动物组织或器官中提取天然有效成分的工艺过程。常用溶剂有水、稀盐、稀酸、稀碱和有机溶剂等。 发酵法是从微生物发酵液中获取代谢产物或其它有关生化产品的过程，包括菌种培养、发酵、提取、纯化等步骤，详见第二章的内容。 化学合成法是根据已知的药物化学结构，采用有机化学合成的原理和方法，制备生化药物的工艺过程。适合于小分子生化药物的制备。 2．多肽类药物 多肽类药物常指多肽类激素和活性多肽，是细胞中具有调节生理和代谢功能的微量有机物，是由2-50个氨基酸残基组成的低分子量化合物，多数无空间构象，在生物体内浓度很低，血液中仅为10－10～10－12 mol/L，但在调节生理功能方面起着非常重要的作用。 多肽类药物的分子较大，不能直接进入靶细胞中，而是先与分布在细胞表面的特异性受体结合，在激活了与受体相连接的效应器后，进一步激活了细胞内的一些酶系，影响了蛋白质的合成，导致特定的生理效应或发挥某种药理作用。 自1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素后，20世纪50年代，多肽类药物的研究主要集中在脑垂体分泌的各种多肽激素方面，60年代，研究重点开始转移到下丘脑神经细胞所分泌的活性肽，70年代以后，脑啡肽及阿片样肽等神经肽的研究进入高潮，近年来，由于发现肠胃激素（即脑-肠肽）具有既存在于胃肠道粘膜内，又能存在于神经系统中的双重分布现象，对其研究开始活跃，在分泌调节机理、活性肽药物剂型的研发、多肽的结构与功能构效关系等方面，均取得了很多进展。 根据作用和分泌的部位，多肽类药物可分为：加压素及其衍生物、催产素及其衍生物、促皮质素及其衍生物、下丘脑-垂体肽激素、消化道激素、血管紧张肽、其它激素和活性肽等（表4-1）。 表1 多肽类药物的分类 分 类 品 种 用 途 加压素 （抗利尿激素） 加压素、脑神经垂体素、鞣酸加压素，鸟加压素等 具利尿和升高血压的作用，用于尿崩症的治疗 催产素 催产素，去氨催产素等 促进子宫及乳腺平滑肌收缩，用于分娩催生及减少产后出血 促皮质素 锌促皮质素、明胶促皮质素、促皮质多肽等 用于肾上腺皮质功能实验，治疗哮喘、癫痫、重症肌无力 下丘脑－垂体肽激素 促甲状腺素释放激素、促乳素释放激素、生长激素释放激素等 控制全身的内分泌 消化道激素 胰泌素、胃泌素、抑胃肽、胃动肽等 促进或抑制胃液分泌 血管紧张肽 血管紧张肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等 急性低血压或休克抢救 其他活性肽 降钙素、脑啡肽、睡眠肽、记忆肽等 天然多肽类药物，除了有些是蛋白质的降解产物外，大多数是由下丘脑、垂体和胃肠道等产生的多种具有特殊生理作用的激素，可从内分泌腺体、组织器官、分泌细胞和体液中提取获得。多肽类药物的化学性质与氨基酸和蛋白质相似，可以充分利用其两性性质、胶体性质、变性特点和电离性质等进行制备，主要的制备方法有提取法、化学合成法和基因工程技术法等三种。 1．提取法多从天然生物 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 中经分离和纯化等工艺制备多肽类药物，主要步骤有：选择适宜的生物细胞、组织和器官为原料，经过细胞破碎后用适宜的溶剂进行提取；然后利用多肽的溶解度、分子形状、分子量大小、电离性质和生物功能专一性等理化性质的差异进行纯化。 2．化学法合成法多采用N,N-二环已基羰酰亚胺（DCCI）为缩合剂，与氨基酸或小肽作用，脱水缩合生成多肽，沉淀副产品N,N-二环已脲（DCU）后，再分离出合成多肽。 3．基因工程技术法是利用基因工程技术对蛋白质进行化学修饰，合成及人工定向 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 或者把特定基因转入宿主细胞进行表达多肽类药物。 1） 降钙素 降钙素是1961年发现的第二个调节钙浓度的多肽激素，能与甲状腺素共同维持血钙平衡状态。临床上可用于骨质疏松症、癌症伴随骨转移、甲状腺功能亢进和成人高血钙症等。 降钙素是由32个氨基酸残基组成的单链多肽，N-末端的半胱氨酸与7位上的半胱氨酸间形成一个二硫键，C-末端为脯氨酰胺，其生物活性与此关系密切，若去掉脯氨酰胺，则生物活性尽失。 自然界中降钙素广泛存在于多种动物体内，由甲状腺内C细胞分泌产生，其提取原料主要有猪甲状腺和鲑鱼、鳗鱼的鳃体。各种不同动物来源的降钙素，氨基酸排列顺序和生物活性有些差异，从鲑鱼中获得的降钙素对人的降钙作用比从其它哺乳动物中分离出的降钙素高20～50倍。 猪降钙素为白色或类白色粉末，效价约为50～200 MRC U/mg。可溶于水和碱性溶液中，不溶于乙醇、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂，难溶于有机酸。粉末25℃以下避光可稳定保存2年，水溶液4℃保存可稳定7～10天，蛋白酶和氧化酶可破坏其活力。 虽然目前已经成功地采用化学合成方法或基因工程技术制备降钙素，但我国仍常用猪甲状腺为原料，采用提取法制备猪降钙素，其工艺过程包括：酸性水溶液提取、有机溶剂沉淀制备粗提物、等电点沉淀去除杂蛋白、层析纯化降钙素、干燥成粉（图4-1）。 图4-1 猪降钙素的制备工艺 2）胸腺素 在1961年Miller等发现了胸腺和抗体的免疫功能及淋巴细胞的发育有关后，人们对胸腺中的活性物质进行了大量的研究，1966年Goldstein首先从小牛胸腺组织中提取并命名了胸腺素。胸腺素能参与抗体的细胞免疫发应，连续诱导T淋巴细胞分化发育的各个阶段，维持机体的免疫平衡状态。 美国1974年开始把小牛胸腺素应用于临床，主要是治疗原发性细胞免疫缺陷病和某些肿瘤，但是由于小牛胸腺来源有限，不能大量投入生产。我国从1975年开始以猪胸腺为原料，提取制备了猪胸腺素注射液（图4-2），主要用于治疗自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、复发性口疮、病毒性疾病、系统性红斑狼疮和部分肿瘤等。与美国生产的小牛胸腺素比较，猪胸腺素活力相当，无毒副作用。 胸腺素是由80℃热稳定的多种活性多肽组成的混合物，相对分子量在1000～15000间，PI值为3.5～9.5，从其免疫活性上可划分成胸腺素α1、α5、α7和β3、β4等5种能调节胸腺依赖淋巴细胞分化和体内外免疫反应的活性组分，其中胸腺素α1为最主要活性成分。 目前国内外仍主要从小牛或猪的胸腺为原料提取获得。国内提取猪胸腺素的工艺一般包括：猪胸腺匀浆、酸性生理盐水提取、热变性沉淀去除杂蛋白、丙酮沉淀制备粗提物、硫酸铵分段盐析富集胸腺素、超滤纯化目标多肽、凝胶过滤除盐、冷冻干燥成粉。（图4-2） 图4-2 采用猪胸腺提取胸腺素的工艺 3 ）胸腺肽 胸腺肽是从冷冻的小牛胸腺中提取的80℃热稳定性较高的多肽混合物，主要成分为平均分子量为9600和7000左右的两类蛋白质，加温至80℃时活性不降低，但水解成氨基酸后活性消失。 胸腺肽有较好的调节细胞免疫力、抗衰老和抗病毒功能，临床上适用于免疫缺陷病、再生障碍性贫血、过敏性哮喘和急慢性病毒性肝炎等的治疗。与胸腺素一样，胸腺肽也曾用于SASS疾病的辅助治疗。 目前，国内外仍采用冷冻的小牛胸腺为原料，经匀浆、浸提、部分热变性、离心、过滤、超滤、添加赋形剂、分装、冻干等工艺过程制备胸腺肽（图4-3）。国内产品称注射用胸腺肽，为类白色或微黄色的无菌冻干制剂。 图4-3 采用小牛胸腺提取胸腺肽的工艺 3．蛋白质类药物 蛋白质是构成生物体的一类最重要的有机含氮化合物，是生命的物质基础，不同的蛋白质，不仅成分不同，其分子的立体结构、理化性质和生理生化功能也各不相同。蛋白质药物按其生物活性和性质主要可分为蛋白质激素、血浆蛋白质、蛋白酶抑制剂等。按蛋白质药物的分子组成则分为：蛋白质激素、天然蛋白质、糖蛋白质激素、粘液糖蛋白和血浆糖蛋白。 蛋白质药物用于防病治病历来已久，临床上使用的蛋白质类药物主要是从动物脏器、组织以及血液中分离获得。虽然20世纪70年代后，随着转基因技术迅速发展和转基因动物技术的突破，人们开始大量研究采用微生物、动物细胞或植物细胞来表达生产转基因蛋白质药物，如胰岛素、干扰素、促红细胞生成素和生长素等，但采用天然动物原料提取蛋白质药物仍有很大的竞争力和市场前景。 蛋白质的提取、纯化可根据蛋白质的等电点、分子形状和大小溶解度、电离性质、亲和性、在溶剂中的分配系数等理化性质的差异，采用沉淀、膜分离、层析、离子交换等技术进行；溶液中蛋白质含量的测定常采用紫外吸收法，双缩脲法、福林-酚试剂法、考马斯亮蓝染色法；蛋白质的纯度则常用高效液相色谱法、电泳法、免疫化学法、生物测定法和分光光度法评价。详细内容参阅第二章提取部分。 1 ）绒膜促性激素 绒膜促性激素 (HCG)是由胎盘滋养层合体细胞分泌的一种糖蛋白，由α-链和β-链两个亚基组成，相对分子量为30000～60000，由氨基酸以共价键与由甘露糖、岩藻糖、半乳糖、乙酰氨基半乳糖和已糖酰氨葡萄糖组成的寡糖链相结合，在糖链的末端有一带负电的唾液酸，每个分子约含有20个分子的唾液酸。HCG的分子中，糖占30％，唾液酸约达10％，葡萄糖胺与半乳糖胺的比例为4:1，其中氨基糖、中性糖、唾液酸含量几乎相等。HCG呈白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂。PI 3.2～3.3，固态粉末较稳定，而水溶液注射液稳定较差。 HCG从受孕的第8天开始分泌，受孕后第20天尿中可测得HCG，当妊娠45天时，尿中HCG的浓度升高，60～70天时达到高峰，此后逐渐下降，到妊娠第18周降至最低水平，分娩后4天左右消失。临床上主要用于男性垂体机制不足所致的性机制过低症和隐睾症、由黄体功能不全引起的功能性子宫出血病和习惯性流产，也用于诱发排卵和治疗不孕不育症，亦可用于皮肤搔痒症、神经性皮炎等。 图4-4 从孕妇尿中提取绒膜促性激素的工艺 2 ）胃膜素 胃膜素又称胃粘膜素，是从猪胃粘膜中提取一种以粘蛋白为主要成分的大分子生化物质。粘蛋白是一类组成结构较复杂的结合蛋白，主要存在于关节滑液、脑脊髓液、血浆及结缔组织，特别是胃肠道中。从胃粘液中分离出来的一种粘蛋白分子量高达2000000，从猪十二指肠中分离出来的一种粘蛋白分子量也高达1500000。 猪胃膜素为白色或米黄色粉末，PI 3.3～5.0，有蛋白胨样臭味和咸味，遇水后溶涨为粘液，遇酸即沉淀，遇热不凝固，其水溶液能被60％浓度以上的乙醇或丙酮沉淀，胃膜素与酸长时间作用，能分解成各种蛋白质和多糖组分，其多糖组分含葡萄糖醛酸、甘露醇、乙酰氨基葡萄糖和乙酰氨基半乳糖，氨基己糖的总量约为5～8％。 胃膜素能抵抗胃蛋白酶的消化并吸附胃酸。临床上用于胃、十二指肠溃疡和胃酸过多症，我国胃膜素多为散剂、片剂，服用不便，国外则将胃膜素与其它抗溃肠药配伍制成复方制剂或胶囊剂使用。 目前，胃膜素的制备主要以猪胃粘膜为原料，采用丙酮分级沉淀法（联产工艺）或者乙醇沉淀法（单产工艺）经过消化、有机溶剂沉淀、脱脂、干燥、粉碎等步骤制得，其中，联产工艺可同时获得胃膜素和胃蛋白酶两种产品。丙酮分级沉淀生产猪胃粘膜素工艺（图4-5）包括：盐酸消化猪胃膜匀浆、乙醇低温沉淀和洗涤、乙醚脱脂、干燥、粉碎、过筛。 图4-5 采用丙酮分级沉淀从猪胃粘膜制备胃膜素的工艺 4．多糖类药物 多糖是生物体内除蛋白质和核酸外的重要生物信息分子。自20世纪60年代以来，多糖类药物研究基本集中在提高免疫功能、降血脂、抗凝血、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤和抗辐射等热点领域。多糖的分子量较大，有直链和支链两种，多可溶于水，水溶液具有一定的粘度，能被酸碱或酶水解成单糖和低聚糖。 近年来，由于分子生物学的发展，逐渐揭示了糖的诸多生物学功能，形成了新兴的糖组学和糖生物学两大研究热点。其中，糖生物学的研究主要集中在对寡糖功能和构效关系方面，从微观角度为免疫学、分子药理学、肿瘤学提供精确的描述，为人类从分子水平上认识和控制复杂的生命现象、人类疾病和新型糖类药物的研制等，提供科学依据。葡糖糖的主要生理功能在于提供抗体所需的能量，而粘多糖类药物则在抗凝血、降血脂、抗动脉粥样硬化、调节抗体免疫力和抗肿瘤方向有较强的生理功能和疗效。如：①粘多糖调节免疫功能方面，主要表现在影响抗体活性，促进淋巴细胞增生，激活吞噬细胞功能，增强抗体消炎和抗疲劳能力。②抗肿瘤和抗凝血功能方面，由于壳聚糖、硫酸软骨素、肝素及其类似物的分子中具有硫酸基或羧基，在一定条件下分子中带有大量负电荷，在血液中癌细胞与其结合后不易在同样带负电荷的血管内膜上附着和迁移，并且这些杂多糖能阻止血小板的凝血和破坏。临床上可广泛用于抗血栓和抗肿瘤中。③降血脂和抗动脉粥样硬化功能主要体现在硫酸软骨素、小分子肝素、壳聚糖及其衍生物能削弱胃肠道中胆汁酸和胆固醇的吸收和消化，降低血液中甘油三酯和低密度蛋白含量和升高高密度蛋白与甘油三酯的比值等方面。 多糖类药物主要来源于动物、植物、微生物和海洋生物，可分为低聚糖、均多糖和杂多糖等三种。研究较多的均多糖品种有来源于植物的人参多糖、刺五加多糖、黄芪多糖和海藻多糖以及来源于微生物的银耳多糖、香菇多糖、灵芝多糖等真菌类多糖。研究较多的杂多糖主要集中在动物来源的肝素、鲨鱼骨粘多糖、甲壳素、壳聚糖、硫酸软骨素和透明质酸等。 虽然均多糖的提取可采用植物和微生物为原料，但杂多糖仍主要是从动物材料中提取、纯化获得，提取时主要采用碱解和酶解方法，而多糖纯化则可采用乙醇分级沉淀、季胺盐络合沉淀合离子交换层析等方法。 1） 肝素 肝素是典型的天然抗凝血药和降血脂药，其抗凝机制是在血液α-球蛋白的共同参与下，抑制凝血酶原转变成凝血酶而起抗凝作用的。临床上广泛用于防止血栓的形成和防治高脂血症和动脉粥样硬化。 肝素是一种含有硫酸基的酸性粘多糖，由α-氨基葡萄糖和β-艾杜糖醛糖和β-葡萄糖醛酸组成，含硫量约9～13％。商品肝素由高、中、低三类不同分子量组成，分子量范围3000～375000。 图4-6 肝素结构式 肝素为聚阴离子，每分子中含有5个硫酸基和2个羧基，呈强酸性，能与阳离子成盐。肝素的糖苷键不易被酸水解，O-硫酸基对酸水解相当稳定，而N-硫酸基对酸水解敏感，在温热的稀酸中会失活，温度越高，pH越低，失活越快。但N-硫酸基在碱性条件下，相当稳定。与氧化剂反应，肝素能被降解成酸性产物，还原剂存在基本上不影响肝素活性。 肝素及其钠盐为白色粉末，无臭无味，有吸湿性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。其游离酸在乙醚中有一定溶解度，肝素纯品在185～220 nm波长处有紫外特征吸收峰，在230～300 nm处无吸收峰。当商品肝素不纯时，最大吸收峰偏移到265～292 nm，最小吸收移至240～260 nm。肝素在890 cm-1和940 cm-1处有红外特征吸收峰，测定1210～1150 cm-1的吸收值可用于肝素的快速测定。 肝素多分布于哺乳动物的肝、肺、肠等内脏器官，且常以糖蛋白的形式存在。目前肝素提取主要以猪肠粘膜、牛肺和猪肺为原料，采用盐解-季胺盐沉淀法、盐解-离子交换法和酶解-离子交换法等三种方法进行。以猪肠粘膜为原料酶解-树脂法提取肝素工艺（图4-7）包括：肠粘膜胰酶酶解、大孔树脂吸附和分级洗脱、乙醇沉淀、脱水、干燥得粗品、高锰酸钾氧化脱色、乙醇沉淀、干燥成粉。 图4-7 采用酶解-树脂法从猪肠粘膜中提取肝素工艺 2) 鲨鱼软骨粘多糖 鲨鱼是自然界中迄今为止发现的唯一不发生癌变的动物。对鲨鱼及其抗癌活性成分的研究始于70年代的美国，研究表明，鲨鱼软骨中的蛋白质因子能抑制血管的生长，其能力为其他软骨的1000倍以上，不但能用于治疗癌症，而且能防止癌细胞的转移和复发。 鲨鱼软骨具有抗癌功能是基于其能抑制新生血管增生，有效遏制恶性肿瘤的周边血管网路的形成，减少流向癌细胞的血液营养和氧气，造成癌细胞不能生长而萎缩坏死的机理。 鲨鱼软骨中富含粘多糖，包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素等，在每2个二糖单元中至少含有一个硫酸基或羧基，显示出优良的生理、药理功能，可用于抗凝血、抗衰老、抗氧化、降血脂、抗病毒和抑制肿瘤等方面，是重要的海洋保健食品和生化药物原料。 鲨鱼粘多糖为杂多糖，是蛋白多糖的糖链部分。一般以鲨鱼软骨为原料，采用碱提或酶解的方法进行提取制备，采用乙醇沉淀、盐析、季铵盐络合沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、超滤分离等方法进行纯化。 目前鲨鱼软骨粘多糖的常用提取工艺有两种：①精选合适的鲨鱼原料，人工剔除鱼肉后，再用蛋白水解酶水解杂蛋白，使鲨鱼软骨的蛋白质含量降至30%以内，软骨经盐酸胍抽提48h，上清液用45~65%丙酮分级沉淀，50~60℃烘干后，以磷酸盐缓冲液制成水溶液，除菌过滤后脱水干燥得粗品。②精选的鲨鱼软骨经脱水、脱脂、粉碎后加6倍6%NaOH溶液抽提4h，中和溶液，水浴处理40min，1%蛋白酶40℃水解2h，10%TCA除杂蛋白，3倍乙醇沉淀。 3) 壳聚糖 甲壳素是可再生的粘多糖，天然产量仅次于纤维素，年产生物量可达100亿吨。在自然界中，广泛存在于蟹、虾、昆虫等甲壳动物的骨骼中和真菌的细胞壁上。壳聚糖为甲壳素经不同程度脱乙酰基产物，是自然界迄今为止发现的膳食纤维中唯一的阳离子聚合物，被欧美日等国科学家称誉为人体第六生命元素。由于壳聚糖对动物、植物的细胞和组织器官无免疫抗原性，毒理研究表明其具有不溶血、无热原性、无致突变性等特点，对动植物和人体有很好的生物相容性和安全性，具有抗肿瘤、降血脂、金属鳌合性、降胆固醇、可生物降解、可成膜性、凝血、抗肿瘤、消炎、杀菌等功能。临床上壳聚糖可用于抗肿瘤的辅助治疗，病原生物感染的防治，心脑血管疾病和糖尿病的防治，护肤品和人造皮肤，创伤愈合海绵，和可降解的手术线的制备等方面。 壳聚糖是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，由α - 氨基-脱氧-D-葡糖糖 （单体以β-(1,4)糖苷键连接而成的均聚物），不溶于水、弱碱溶液及大多数有机溶剂中，也不溶于多元弱酸，但可溶于稀的盐酸、硝酸等无机一元酸和大多数有机酸中。在稀酸中，壳聚糖的主链将缓慢水解断裂，粘度逐渐降低，分子量也逐渐减小。因此，实际使用时常随用随配。壳聚糖的溶解度取决于其脱乙酰程度和水溶液中H+浓度，一般地，脱乙酰度越高，H+浓度越大，则壳聚糖的溶解度越大。 目前，制备壳聚糖主要从甲壳动物的外壳或微生物细胞壁中提取。国内主要采用从虾、蟹甲壳中提取的工艺。由于动物甲壳中主要含有碳酸钙、甲壳素和蛋白质三种成分，可采用先酸浸脱盐、后碱浸脱蛋白的浸泡预处理方法，可较易获得甲壳素（图4-8）。 图4-8 甲壳素的制备工艺 大分子量壳聚糖常要现用现配，使其应用受到很大的限制。由于分子量≤10000的水溶性低聚壳聚糖具有更独特和优越的生理活性和抑菌、保鲜、成膜、降脂、抗病毒等功能，已成为新的研究热点。 目前，水溶性的低聚壳聚糖的制备方法主要有：化学降解法和酶降解法两种。前者包括酸降解、氧化降解、化学降解等。后者所使用的酶主要有：壳聚糖酶、溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等。 采用H2O2氧化法或纤维素酶水解制备水溶性、低分子壳聚糖工艺，示于图4-9。 图4-9 水溶性壳聚糖（平均分子量小于5000）制备工艺 5.酶类药物 酶和辅酶是我国生化药物中发展比较快的一类。近代酶学研究在对酶的产生、存在、化学本质、作用机制、制造方法以及用途等方面，取得了许多卓越的成就。目前，世界上已知酶2000多种，结晶出来的酶约100种，已经应用的有120多种，新开发的、正在实验研究中的酶有100多种。 在生物化学上，依据各种酶所催化反应的类型，国际酶学委员会把酶分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、解合酶类、异构酶类、合成酶类。每一种具体的酶在分类系统中的位置，用特定的四个数字组成的编号表示，可从编号中了解每种酶的类型和性质。酶类药物依据其功效和临床应用分为：消化酶、抗炎、粘痰溶解酶、循环酶、抗癌酶和复合酶等。 酶类药物则主要是从动物的腺体、组织和体液中，采用离子交换、沉淀、层析、膜分离、凝胶过滤、超速离心等方法进行分离制备，一般都包括三个基本步骤：提取、纯化和精制。 提取条件的选择，取决于酶的溶解性质、稳定性及与其它物质的相互关系。提取溶剂的选择，一般可参考已有的文献报道。目前很多酶类药物已经能采用微生物培养或从植物中提取获得，但诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶和超氧化物歧化酶等，采用从动物活 1 )胃蛋白酶 胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，是酶类物质中的第二个结晶酶。以酶原的形式广泛存在于哺乳动物、鸟类、爬虫类及鱼类的胃液中，临床上主要用于助消化。胃蛋白酶能水解多数天然蛋白底物，尤其对两个相邻芳香族氨基酸构成的肽键最为敏感。 胃蛋白酶为淡黄色粉末，吸湿性强，易溶于水，水溶液呈酸性反应，难溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂。干酶较稳定，热至100℃，10分钟不失活。在水中受热70℃以上或pH 6．2以上开始失活，pH大于8呈不可逆失活。在酸性溶液中较稳定，但在2 mol/L以上浓度的盐酸中也会慢慢失活。结晶胃蛋白酶呈针状或板状，分子量为34500，最适pH l．5～2.0，可溶于70％乙醇和pH 4的20％乙醇中，在冷的磺基水杨酸中不沉淀，加热后才产生沉淀。 目前制造胃蛋白酶的制备是以猪胃粘膜为原料，经自溶、氯仿或乙醚脱脂除杂、浓缩、干燥等步骤获得（图4-10）。 2 )尿激酶 尿激酶是由动物肾脏产生的一种碱性的蛋白水解酶，酶活性中心的必需氨基酸为丝氨酸和组氨酸，广泛应用于治疗各种血栓形成或血栓梗塞等疾病。 尿激酶主要有31300和54700两种。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下被激活生成尿胃蛋白酶，尿胃蛋白酶可把大分子量54700的天然尿激酶降解成小分子量31300的尿激酶。分子量54700的天然尿激酶由两条肽链通过二硫键连接而成。 尿激酶为白色冻干粉，易溶于水，等电点为pH 8～9，冻干状态于4。C可稳定数年，1mg／m1的无菌溶液可在冰箱中保存3天。在盐浓度低于0.03 mol／L氯化钠时稳定性下降，在极低的盐浓度时，随着酶的失活产生沉淀。0.1％EDTA、人血白蛋白或明胶可防止酶的表面变性作用，0.005％鱼精及其盐对酶有良好的稳定作用，在制备时，加入上述试剂可明显提高收率。二硫代苏糖醇、氨基已酸等对酶有抑制作用。 尿激酶主要存在于人和哺乳动物的尿中，可从尿中提取。但由于尿激酶在尿中含量很低，人尿中仅有5～6 IU/ml，因此提取成败关键是选择适当、良好的吸附剂，国内外的吸附剂有硅酸铝、硫酸钡、硅藻土、氧化硅胶、多孔玻璃、纤维素、各种类型分子筛、弱酸性和强酸性离子交换树脂等。目前较常采用的是硅藻土吸附法和树脂吸附法（图4-11）。 图4-11 树脂吸附法提取尿激酶的工艺 3) 超氧化歧化酶 超氧化歧化酶是一种含有Cu、Mn或Fe的热稳定性较高的金属酶，是一种重要的超氧阴离子自由基清除剂，临床上广泛用于防治自身免疫性疾病、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、治疗氧中毒和心脑血管疾病等。 超氧化歧化酶几乎在人、动物、植物和微生物中均有分布，原料极为丰富。目前主要从猪血中提取Cu-SOD、Zn-SOD（图4-11），从肝脏中提取Mn-SOD，从大肠杆菌中提取Fe-SOD。由于是金属酶，提取过程要注意活性中心金属离子的保护。SOD活性测定两种常用方法为黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法和邻苯三酚自氧化法。其纯度评价指标有均一性，酶比活力和金属离子含量，氨基酸含量和吸收光谱等。猪血Cu·Zn－SOD相对分子量为31600，pH 7.6～9.0时稳定，pH 6.0以下和pH 12.0以上不稳定，具有较强的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力，但80℃热稳定性不如Cu·Zn－SOD。 图4-12以猪血为原料提取Gu-SOD、Zn-SOD的工艺 作业： 1． 提取的依据？ 2． 提取的影响因素？ 3． 蛋白质的五大性质及其在 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 和纯化上的用途。 4． 扩散方程式的物理意义？实际上该如何应用？ 5． 溶解度的差异用于提取的两个主要目的？ 6． 提取的原则有哪些？ 7． 名词解释：提取，蛋白质的等电点，蛋白质的沉淀作用，蛋白质的变性作用，核酸消光系数，核酸的变性和复性，增色效应，减色效应。 （冷冻干燥） （浓缩） 2万分子量超滤膜 SOD洗脱液 （吸附、洗脱） DEAE－Sephadex A－50动态吸附；pH7.6， 2.5～50mmol/L磷酸钾缓冲液动态梯度解吸 30min 透析液 （透析） 动态透析6～8h （去除不溶性蛋白） 去离子水溶解，0℃，离心 丙酮，0℃，离心 （沉淀） 丙酮，0℃，离心 黄绿色澄清液 （热处理） 去离子水溶解， 65℃, 15min，离心 30min 沉淀物 （沉淀） 丙酮，0℃，离心 上清液 （除血红蛋白） 95％乙醇，氯仿，15min，离心30min 溶血物 （溶血） 去离子水溶解， 5℃，30min 干净红细胞 （洗浮） 生理盐水，反复洗3次 红细胞 （收集，除血浆） 10℃，离心 新鲜猪血 注射用尿激酶 （制剂） 冻干 精制尿激酶 （吸附、洗脱） 724柱，磷酸氢二钠，pH6.4,-2～0℃,6～7h 尿激酶粗品 重复DEAE－纤维素除杂步骤 重复溶解除杂步骤 沉淀物 （盐析） 65％硫酸铵，-2～0℃，4h，过滤 流出液 （离子交换剂除杂质） DEAE-纤维素动态吸附pH7.5，流速0.5Bv/h 滤液 （溶解除杂） pH6.6，0.05mol/L 磷酸盐缓冲液： 1％氨水（2：3）溶解,过滤 沉淀物 （盐析） 65% 硫酸铵，pH3.0，0℃，6h，过滤 洗脱液 （洗脱） 2％氨水，1h， 1mol/L 氯化钠 （洗脱） 树脂装柱，去离子水快洗，pH6.4，0.05～0.1mol/L磷酸盐缓冲液慢洗 吸附物 （吸附） 调pH6.0，724（H＋型）树脂静态吸附1.5h 清尿液 （原料碱化处理） 调pH9，10℃， 1.5h，离心 男性尿 胃蛋白酶成品 （浓缩、干燥） 40℃以下 上清液 （脱脂、除杂） 氯仿或乙醚，24～48h 自溶液 （自溶、过滤） 水，HCl，45～48℃，3～4h 猪胃粘膜 甲壳素 （脱乙酰基） 浓氢氧化钠 壳聚糖粗品 （漂洗） 水 （烘干） 60~85℃ （醋酸酸溶） 1%醋酸溶液，50℃， 200rpm，40min （过氧化氢氧化法降解） 0.67%过氧化氢溶液， 50℃，40min 低分子量壳聚糖溶液 （中和终止反应） 氢氧化钠调 pH值5.8~6.0 （还原终止反应） 0.3%亚硫酸氢钠还原 （纳滤脱盐） （浓缩） 65℃，0.095MPa （干燥） 水溶性壳聚糖固体 （漂白） 高锰酸钾，亚硫酸氢钠溶液 （清洗） 水 （清洗） 水 （脱蛋白） 10%氢氧化钠 （清洗） 水 （晒干） 甲壳素 除去无机盐的壳 （浸酸脱钙） 4%~6%盐酸 虾蟹壳 肝素钠精品 （干燥） 无水乙醇，丙酮，乙醚 沉淀物 （二次沉淀） 1％氯化钠溶解， 95％乙醇，4℃，6h 沉淀物 （沉淀） 95％乙醇，pH6.4， 4℃，6h 滤液 （脱色） 2％ 氯化钠溶解，高锰酸钾氧化脱色，pH8，80℃，2.5h，滑石粉助滤 肝素钠粗品 （干燥） 丙酮 （脱水） 无水乙醇 沉淀物 （沉淀） 95％乙醇，4℃， 8～12h，离心 合并洗脱液 (静态洗脱) 依序用2mol/L、1.2mol/L、 5mol/L和3mol/L氯化钠 吸附物 （静态吸附） D-254树脂，pH7，5h 滤液 （除杂过滤） pH6.5，90℃，20min，过滤 （酶解） pH8. 0，5％氯化钠，90℃ （保温处理） 胰浆，调pH8.5～9.0，45℃，3h 肠粘膜 胃膜素成品 （粉碎过筛） 80目筛 脱脂胃膜素 （干燥） 50℃ （脱脂） 乙醚 胃膜素粗提物 （洗涤） 70％乙醇 沉淀 （有机溶剂沉淀） pH4～5，70℃乙醇，0～5℃，12h 消化液 （盐酸消化） pH3～3.5,40～45℃，4h，过滤 胃粘膜浆 绞碎 胃粘膜 HLG精品 （真空干燥） 0.095Mpa，-50℃ （丙酮洗涤） 0~4℃，3~5次 沉淀 （乙醇沉淀） 2BV无水乙醇，-20℃，5000rpm离心 去热原HLG液 （过氧化氢除热原） 1.0mmol/L过氧化氢溶液，3h HLG浓缩液 （超滤浓缩） 分子量300000超滤膜，反复3次 合并具HLG活性洗脱液 （动态解吸） 10%醋酸铵-40%乙醇溶液，0.2Br/h （醇洗至无色） 75%乙醇，1BV/h,2-3BV （水洗至中性） 1BV/h，2~3BV （硅酸铝动态吸附） 50~80目，2BV/h 酸性滤液 （过滤） 200目绢布 （盐酸酸化） pH3~4, 100rpm, 2h, 静置2h 碱化滤液 （过滤） 200目绢布 （氢氧化钠碱化） pH8~9, 100rpm, 30min, 静置60min 新鲜孕妇尿 注射用胸腺肽 （分装、冻干） -20℃冷藏，3％甘露醇赋形 精制液 （超滤、提纯） 10 000以下分子量的超滤膜 滤液 (离心、过滤) 融化后，2℃5000r/min，40min (选择性热变性) 融化后，80℃，5min；-20℃冷藏72h 胸腺匀浆 （提取） 10℃浸提， -20℃冷藏48h （均浆） 10 000r/min，1min 绞碎胸腺 （绞碎处理） 4℃无菌水 小牛胸腺 无热原胸腺素粉 （除热原） pH 6.0，水溶，乙醚，1h，离心 胸腺素丙酮粉纯品 （丙酮沉淀） －10℃，4h， 绢布过滤 （层析纯化） pH 7.0，DEAE-纤维素动态吸附，pH4.0，0.002mol/L 磷酸盐缓冲液动态解吸 浓缩液 (分段盐析除杂) 50％硫酸铵，4℃，pH 7.0，4h，离心 上清液 （超滤浓缩和纳滤除盐） 0.01mol/L Tri-HCl缓冲液，pH8.0 6000分子量超滤膜，200分子量纳滤膜 盐析物 (分段盐析除杂) 25％硫酸铵，4℃，pH 7.0，4h，离心 上清液 （溶解除杂） pH 7.0，0.01mol/L磷酸盐缓冲液、搅拌30min，离心 胸腺素粗提物 （丙酮沉淀） －10℃，4h，绢布过滤 上清液 （过滤） 100目绢布 (沉淀物陈化) 10℃，30min （热变性除杂蛋白） pH 7，80℃，15min 提取液 （过滤） 60目绢布 （提取） pH 3的生理盐水,10℃,4 h （捣碎处理） 水 胸腺匀浆 猪胸腺 猪降钙素粉末 （冷冻干燥） 解析液 （层析纯化） 羧甲基纤维素动态吸附，pH4.5，0.02mol/L 醋酸钠缓冲液动态吸附 上清液 （除杂蛋白） 3mol/L氯化钠溶解， 调pH2.5，静置 沉淀物 （沉淀） 异戊醇：醋酸：水=20：32：48 50℃，2h，硅藻土助滤 提取液 （提取） 0.1 mol/L盐酸，60℃，1 h 猪甲状腺丙酮粉 SOD成品