实验一MS培养基配制和灭菌
实验一 MS培养基配制和灭菌
一(目的和要求:
1. 学会MS培养基的制作方法;
2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。
二、仪器与试剂
1. 仪器:灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯(500ml)、培养皿、移液管等 2. 试剂:MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH
和 1N HCl
三、方法步骤
(一)配方
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
: 以MS为基本培养基(mg/L)
No. 6-BA NAA IBA
0 0 CK
0.5 0.1 1
1.0 0.1 2
2.0 0.2 3
1.0 4 0.2
5 2.0 0.2 (二) 配制培养基
(1) 溶化琼脂:量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。
(2) 各种母液的吸取:Macro-e 50ml
Micro-e 1ml
有机成分 1ml
Fe盐 5ml
肌醇 10ml
加在一起，倒入烧杯(1L)
(3)加入糖:称取 30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的 300ml 蒸馏水中。
1
(4)根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。
(5)定容:加蒸馏水(用量杯)。
(6)调节pH至5.8，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。
(7)分装:30,40 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。
(8)用具清理和洗涤:各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。
(三)灭菌:用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为0.12,0.15MPa,温度为120,126?，保持15~20 min。
具体操作步骤:
1. 加水;
2. 把包扎好的培养基装入高压锅;
3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀; 4. 加热;
5. 排除冷空气;
关闭放气阀，待压力升到 1Kg位置时，开始计算灭菌时间，6. 排除冷空气后,
一般在 1Kg 压力(121?)下灭菌 15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。 7. 灭菌时间达到 20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。 四.作业
1. 总结配制培养基的注意事项。
2. 制作培养基前为何要提前配制母液?
2
实验二 短柄五加无性系建立
一(目的和要求:
1. 学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作;
2. 掌握无菌操作技术。
材料、仪器与试剂 二、
1.材料:短柄五加休眠枝
短柄五加( Eleutherococcus brachypus Harms. ) 为五加科五加属灌木，在我国的分布范围极其狭窄，主要分布于西北黄土高原，逐渐被认为是濒危植物。其茎具有较高的药用价值，有治疗神经衰弱、妇女更年期综合症、继发性高血压、白细胞减少等功效。
2.仪器:超净工作台、灭菌锅、弯头剪、枪状镊子、烧杯(500ml)、培养皿等
3.试剂:配制好的 MS培养基各种母液、1mol/L的NaOH、1mol/LHCL、0.1%的升汞、70%的乙醇。
三、方法步骤
(一) 无菌操作
准备阶段
接种室:1、紫外灯提前照20-30min。
2、70%乙醇或新洁尔喷雾消毒。
操作人员:1、穿专用实验服，戴口罩。
2、剪短指甲，流水洗手三次。
操作阶段
1、清理工作台面，70%乙醇擦三次。
2、70%乙醇擦手三次。
3、避免说话和来回走动
(二) 无性系建立
1. 配制启动培养基
CK MS
3
? MS+6-BA 0. 5 mg/L + NAA0.1mg/L ? MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA0.1mg/L ? MS+6-BA 2. 0 mg/L + NAA0.2mg/L ? MS+6-BA 1. 0 mg/L + IBA0.2mg/L
? MS+6-BA 2. 0 mg/L + IBA0.2mg/L 2. 材料的选择:选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。
3. 培养步骤:
(1)外植体消毒:
去杂?流水水洗1,2h?70%乙醇(8-10s)?无菌水洗3-5次?0.1%HgCl2
(10min)?无菌水水洗5次
(2)接种:
用剪刀将灭菌后的枝条剪成 长约1,1.5 cm的单芽茎段。将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，每瓶只接一个。对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。
(3)培养:培养物置于 25? 左右的培养室中，每天光照 12 小时，光照度为 850-1200lx。
(4)观察:定期观察培养物的生长情况，及时将污染材料取出。 四、 作业
1、总结本实验外植体的消毒过程及关键步骤。
2、进行试验结果的观测、比较和记录，并通过分析筛选出月季无性系建立的最佳培养基配方。
植物生长调节剂
接种数/个 萌芽数/个 污染数/个 萌芽率/% 芽生长情况 No.
6-BA NAA IBA
CK 0 0 1 0.5 0.1 2 1. 0 0.1 3 2. 0 0.2 4 1. 0 0.2 5 2. 0 0.2
4
浙公网安备 33021202002483