生物工程实践报告

生物工程实践实习报告 专    业：                            班    级：                              学     号：                              姓     名：                        时    间：                指导教师：                          植物组织培养简介 植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。 植物组织培养一般分为以下几种： 1、胚胎培养 ，指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养； 2、器官培养，指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养； 3、组织培养 ，指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养；4、细胞培养 ，指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养；5、原生质体培养，指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。 植物组织培养技术诞生以来，由于其极大的优势备受世界欢迎，因而得到了长足的发展。其优点有：不受生长季节的限制；不携带病毒；培养周期短，可用组培中的愈伤组织支取特殊的生化制品；可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物；可诱导之分化成需要的器官，如根和芽；解决有些植物产种子少或无的难题；不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征；投资少，经济效益高；繁殖方式多，试用品种多。 植物组织培养技术在提高农作物产量、培育农作物新品种等方面具有广阔的应用前景，因此越来越受到各国科学家的重视。20世纪60年代以后，植物组织培养技术开始在生产上应用，并且逐渐朝着产业化方向发展。随着科学技术的不断进步，植物组织培养这门崭新的技术将日益普及和深入，成为现代农业生产中重要的技术手段。 可以预见，在二十一世纪，世界人口激增，第二产业和第三产业高度发达，世界耕地面积不断减少，人们对食品，生活水平要求不断提高的情况下，各国一定会大力发展植物组织培养技术，不断开发新技术，其广阔前景可见一斑。 植物组织培养 一、实验目的： 1. 掌握MS培养基的配制； 2. 掌握无菌操作方法，将外植体培育成愈伤组织并进一步分化成幼苗； 3. 了解认识植物组织培养的应用与前景。 二、实验原理： 植物细胞全能性理论：植物体的每一个细胞都含有整株植物的全部遗传信息，都有分化成一个完整植株的潜在能力。 多数植物体细胞经过一系列的生长分化，丧失分裂能力而演变成各种类型的细胞，其形态结构和功能各不相同，丢失分裂能力。细胞分化是可逆的，分化的细胞，在一定条件下，可以转变成胚性状态，重新获得分裂能力，称为脱分化。进行立体培养时，植物组织或器官通过脱分化形成愈伤组织。由脱分化形成的愈伤组织在适当培养基上，一定条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成具有根、茎、叶的完整植体。 由愈伤组织形成再生植株主要有两种途径，一种为器官形成途径，即在愈伤组织的不同部位分别独立形成不定根和不定芽；另一种称为体细胞胚胎发生，即在愈伤组织表面或内部形成类似于合子胚的称之为胚状体的结构，而后发育为一株完整的植株。 激素是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽极少，但他们对外植体愈伤组织诱导和器官分化起着重要的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素类最为常用。 三 实验内容及步骤： <一>  MS培养基母液的配制 一、 实验仪器和药品： 烧杯、玻璃棒、电子天平、容量瓶、移液管、标签、量筒、试剂瓶 95%酒精、1mol/L HCl、1mol/L NaOH、几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐、植物激素等药品以及蒸馏水。 二、 方法和步骤： （一）MS大量元素母液的配制（配制1000ml，扩大10倍）质量单位：mg 序号 化学成分 培养基配方用量 扩大10倍称量 ① NH4NO3 1650 16500 ② KNO3 1900 19000 ③ MgSO4.7H2O 370 3700 ④ KH2PO4 170 1700 ⑤ CaCl2.6H2O 655.5 6555         CaCl2·6H2O单独配制，不与其他四个混合。 （二）MS微量元素母液的配制（配制100ml，扩大1000倍）质量单位：mg 序号 化学成分 培养基配方用量 扩大100倍称量 ① KI 0.83 83 ② H3BO3 6.2 620 ③ MnSO4·4H2O 22.3 2230 ④ ZnSO4·7H2O 8.6 860 ⑤ Na2MoO4·2H2O 0.25 25 ⑥ CuSO4·5H2O 0.025 2.5 ⑦ CoCl2·6H2O 0.025 2.5         （三）MS铁盐母液（配制1000ml,扩大200倍）质量单位：mg 序号 化学成分 培养基配方用量 扩大200倍称量 ① FeSO4·7H2O 27.8 5560 ② Na2－EDTA 37.3 7460         注意：配制时，两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。 (四) MS有机母液的配制(配制100ml，扩大10倍) 质量单位：mg 序号 化学成分 培养基配方用量 扩大10倍称量 ① 甘氨酸 2 20 ② 烟酸 0.5 5 ③ 盐酸硫胺素（Vb1） 0.1 1 ④ 盐酸吡哆醇（Vb6） 0.5 5 ⑤ 肌醇 100 1000         （五）生长调节剂：单独配制，取药品适量，置于小烧杯中，用乙醇作溶剂溶解。 各部分母液配制时，按扩大后的倍数称量，分别溶解后混合在一起，然后定容至一定体积。大量元素、微量元素、铁盐、有机物质实际上分别扩大倍数为10倍、1000倍、200倍、100倍。 配制培养基母液时注意事项： （1）一些离子易发生沉淀，可先少量水溶解，在按配方顺序依次混合； （2）配制母液时用蒸馏水或重蒸馏水； （3）药品应用化学纯或分析纯； （4）溶解生长素时，可用少量0.1mol/L的NaOH 或95%酒精溶解，溶解分裂素类用0.1mol/L的HCl加热溶解。如再加蒸馏水，易产生白色沉淀，此时可加入热水； （5）所用各种容器一定要洗净，烘干； （6）电子天平称量药品时，一定要用称量纸，有腐蚀性的药品放在小烧杯中称量。 三 母液的保存： 1、装瓶：将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。（注意将易分解、氧化者，放入棕色瓶中） 2、贮藏：4℃冰箱。 <二>  MS固体培养基的配制 一、 实验仪器和药品： 1、仪器：酸度计或pH试纸、电磁搅拌器、电炉； 2、用具：高压灭菌锅、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶（三角瓶）、烧杯、标签； 3、试剂：配制好的MS培养基的各种母液、生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1mol/LNaOH 溶液，0.1 mol/L HCl溶液。 二、 方法和步骤： 1、 将配置好的MS培养基母液按顺序排列好，并观察一下。 2、 取一些蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入大烧杯中。 3、 按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。 母液吸取量=配置培养基的数量（ml）/母液扩大倍数 物质 加入体积 大量元素母液（10倍） 100ml 微量元素母液（1000倍） 1ml 有机物质母液（100倍） 10ml 铁盐母液（200倍） 5ml     4、 通过计算，本组使用萘乙酸（NAA）0.01mol，并取所需的量溶于少量乙醇，放入其中。 5、 称取蔗糖30克，溶解后，混合上述溶液。 6、 作以上工作时，同时称取琼脂10克，在电炉上加热溶解后，边搅拌边混合入上述溶液中。 7、 用温水定容到1000（防止琼脂凝固），用PH试纸测PH（一般为5.8—6.0），若PH偏酸（或偏碱），则用0.1mol/LNaOH(或HCl)调PH。 8、 分装，将1000ml培养基分装到30个50ml培养瓶中，每瓶30ml。    9、 封口，用带纱布的棉塞封口，包上牛皮纸，注明培养基名称、配制时间。  以上各步都完成后，就是培养基的灭菌步骤（与以上配制培养基的同时，我们还要 把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗，然后自然晾干或烘 箱干燥。同时做酒精棉塞以及棉球）。 MS固体培养基的灭菌使用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法），步骤如下： 1、 包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。 2、 装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！） 3、 装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶、要制备的消毒酒精棉以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。 4、 灭菌：温度为121℃时，维持20分钟，即可达到灭菌的目的。灭菌完成后，待灭菌锅内压力降到零时，打开灭菌锅，取出三角瓶，放平，待培养基凝固后备用。 注意：（1）IAA受热不稳定，不能和培养基一起灭菌，要过滤除菌； （2）用高压灭菌锅时，应先检查其中水是否合适。 <三>  接种和培养 一、 实验仪器设备、试剂和材料： 仪器和用品：超净工作台、培养皿、培养基、剪刀、镊子、量筒、酒精灯、滤纸、无菌报纸、棉塞、纱布、牛皮纸、软毛刷。 试剂：无菌水、蒸馏水、95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.01%升汞、来苏尔、肥皂。 材料：植物的嫩茎。 二、 方法和步骤： 1、培养材料的采集： 在楼下采集植物嫩茎（柳树）。材料最好用植株上一年到两年生的带芽的新枝条，因为这些组织中含有较多的分生组织细胞，易于灭菌和诱导愈伤组织。 2、培养材料的清洗和消毒： ⑴清洗：先将采集到的材料用自来水流水冲洗5min,然后用中性洗衣粉液清洗，最后再用自来水流水冲洗30min。材料上较小的部位或难清洗到的部位可用软毛刷轻轻刷洗，不可擦破外皮； ⑵消毒：在超净工作台上进行。无菌环境中将清洗过的材料放入70％酒精中浸泡30～60s，再将材料移入0.01％升汞中消毒10min，取出后用无菌水冲洗三四次。 3、制备外植体： 开始工作前，先进行超净工作台消毒 ，开启紫外灯，照射30分钟后，关闭紫外灯,打开照明灯并开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用70% 的酒精棉球擦净工作台。开始前用水和肥皂洗净双手，然后用蘸有70%的酒精棉球擦拭双手和剪刀、镊子，金属用具在酒精灯火焰上稍微灼烧，冷却后再按正确方法进行接种。在酒精灯火焰旁的无菌环境中将材料剪切成2厘米左右的小段，尽量在各个节间切断。严禁用手触摸材料，要用镊子夹取。 4、 接种： 取出制备好的三角瓶中的MS培养基，，在酒精灯火焰旁拔出棉塞，棉塞和瓶口在火焰上进行杀菌。棉塞拿在手中或置于无菌报纸上。镊子放在火焰上消毒冷却后，夹取外植体竖直插在三角瓶中的MS培养基上，每个三角瓶中放3-4个。然后在火焰胖无菌环境中塞上棉塞，缠好棉线。 5、 培养： 接种好的培养基置于培养箱中，给予光照、温度等适宜条件。 6、 观察： 一周后观察培养结果。 注：升汞是剧毒药品，一定不要用手直接接触，用完后要放在回收的废液缸里，不能直接倒入下水道中。 实验记录：一周后观察培养结果。 总  结 至此，大二第三学期的生物工程专业实习已经全部结束。这次实验安排在学习专业课之前，使我们对生物工程专业有了一个感性的认识。虽然，经过查找资料和老师的讲解、自己的实践，在很多原理方面认识还不是很透彻，实验技术方面还不是很娴熟，但是，对我们来说，作为常年守在大学校园里的我们学生，这是一次非常难得的专业实习机会，我对专业有了极大的兴趣，对于实验技术来说，我充满渴望。 大三，是人生的重要转折点，也是非常忙碌的一年，在未来的一学年中，我们要做出很多对以后的职业生涯、生活方式和生活范围有重大影响的决定。我们即将踏入社会的大熔炉中，要想有光明的未来，未雨绸缪，现在就要掌握更多的专业技术，实验技术。由于条件限制，我们在大学期间能自己亲手操作的实验少之又少，这次专业实习，是在老师的指导下，全部由自己亲手操作实践，一定要把握每次机会，认真准备，细心发现，充分思考。 通过十多天的专业实践，我深刻了解了植物组织培养的步骤，生物方面的无菌操作观念深入人心。培养基母液的配制、培养基的制备、全面灭菌、外植体的制备、接种、严格条件培养，还有以后的观察，这许许多多的方面是我原来不曾接触的，不光是对实验原理有了更深刻的理解，对操作技术有了更娴熟的锻炼，其工作态度、工作观念对我们今后的学习工作也是非常有帮助的。科学工作者严谨的工作态度给我留下了深刻的印象，一定要一丝不苟，严谨务实。 最后，感谢学院领导为我们安排这次专业实践，感谢王老师和骆老师为我们亲自指导实验，真的是一次难得的机会，受益颇丰。