安络小皮伞_Marasmius_androsaceus_Mun141菌株的选育

安络小皮伞_Marasmius_androsaceus_Mun141菌株的选育 () 第25卷 第1期. 25 . 1 自然科学版河南师范大学学报 V olN o 1997年2月 () . 1997 J ou rn a l of H en a n N o rm a l U n iv e rs i ty N a tu ra l S c ien ceF eb ()安络小皮伞 M a ra sm iu s an d ro saceu s α 3141菌株的选育 M u n aabcc 李宗义聂国兴孙新彦王爱玲李亚卿 (). 河南师范大学生物系, 453002, 新乡; . 漯河市第一制药厂; . 安阳市农业局 abc 作 者 采 用 分 离、纯 化 和 诱 变 等 方 法, 运 用 液 体 发 酵, 筛 选 出 安 络 小 皮 伞 摘要 () 141高产菌株经30 发酵罐放大试验, 结果显示, 帄均氯仿提取物 rM a r sm iu s and ro saceu sM un t () () 含量为12. 38% 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差?45. 38, 较原菌株 提高50. 24% , 且性能稳定. 同时, 筛选出适宜M aA # # 生长的7固面培养基. 141菌株在7固体培养基上, 菌丝萌发早, 生长速度快, 粗壮 141M un M un # 浓密, 色泽纯正, 其生长量高出原1固面培养基5- 7%. 关键词 安络小皮伞; 液体发酵; 诱变; 筛选 分类号 949. 81Q 3 () 安络小皮伞 为我国民间传统的药用真菌. 通过深层发酵培M a r sm iu s an d ro saceu s 养菌丝体, 经抽提制成安络痛浸膏或胶囊, 具有止痛, 消炎等功效, 对三叉神经痛, 坐骨神经 痛, 面神经麻痹, 偏头痛和风湿性关炎等疗效较好; 对中轻度麻风神经痛, 腰肌劳损等也有缓 5. 10 解作用. 河南省安络痛的产量占全国总产量45. 43% , 但是, 在生产上菌种严重衰退和污 染, 产量低, 质量也达不到《河南省药品标准》. 作者以生产用菌株为供试菌株, 通过分离, 纯化和诱变, 选育出菌株, 并 141M aA M u n # 筛选出适于该菌株生长的7固体培养基. 经系统考查, 证明发酵性能好, 遗传性状稳定, 收 率高. 并经30 发酵罐放大试验, 氯仿提取物含量较对照提高50. 24% , 产品质量超过《河南 t 省药品标准》的各项规定. 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1. 1 供试菌株 () 安络小皮伞 , 漯河市第一制药厂提供.M a r sm iu s an d ro saceu sM aA 1. 2 培养基 # # () () () ()固体斜面 或帄板培养基: 1, 14略; 摇瓶种子培养基 略; 发酵培养基 略. 1, 5, 7 1. 3 培养条件 ( 试管斜面: 25?恒温培养9, 10; 摇瓶种子: 装量60ƒ300三角瓶, 接种量1ƒ2斜面 约dm l 2 ) 1摇瓶发酵: 装量90500三角瓶, 接种量15% , 振荡培养5, 6.; ƒcm , 振荡培养6, 7dm lm l d 摇床使用型微生物多用培养箱, 旋转式, 转速180 恒温25?.ƒ, W D P rm in α 文稿收到日期01: 1996- 09- 25.3 河南省科委资助项目. 1. 4 试验步骤 8 初筛复筛 u , v 1. 4. 1 筛选 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 第一次诱变; 出发菌株选200个菌落选50株( ) ( ) 每株1瓶每株5瓶 N T G 初筛复筛 选5株. 第二次诱变: 出发菌株 40瓶每株 选50株 选5株 系统考查,ƒ ( ) ( ) 每株1瓶每株5瓶 择优选用. 2. 9 1. 4. 2 抽提测定?发酵液离 心, 回流, 浓缩, 氯仿提取. 测定发酵液 值, 总糖, 还原 pH 糖, 氯仿提取物含量及收率. 1. 5 141菌株的获得M u n 1. 5. 1 处理U V # 1. 5. 1. 1 照射 活化出发菌株, 点接1帄板 , 25?培养3- 4. 挑取外缘菌丝整壮的菌 U V d 落切取顶端帅嫩菌丝2- 3, 和适量无菌生理盐水放混旋器中搅拌, 稀释后用脱脂棉过滤 mm 5 ( ) 制成菌丝片段悬液. 稀释至10个菌丝片段ƒ分装培养皿 7内涂布均匀, 按常规方法, m lΥcm () 用不同剂量 60″、90″、120″等照射.U V ( 1. 5. 1. 2 分纯突变体 照射后稀释, 用毛细管点样器在灭菌培养皿盖内壁点样 皿底倾入8 # ) - 10? 4% 水琼脂, 镜检标记含单细胞的液滴, 并于液滴上覆盖1固体培养基, 暗培养48m l # - 72. 挑取微菌落移入1帄板培养. 长出菌落后编号, 移接斜面, 冰箱保存备用.h 1. 5. 1. 3 筛选 经初筛和复筛, 在致死率为68. 85, 76. 32% 的处理中获得5个菌株, 其中 () 帄均氯仿提取物含量为9. 3568% 标准差?45. 28, 高出且性能稳定, 选 24. 22% , M 26 M aA 作为第二次诱变的出发菌株. 1. 5. 2 处理 以为出发菌株, 采用上述同样方法挑取菌落外缘整壮的帅嫩菌丝 N T G M 26 片段和 的磷酸缓冲液混合放混旋器搅拌、稀释、脱脂棉过滤, 再用同样缓冲液制备菌 6. 8pH 丝片段悬液, 与 处理液混合, 在最终浓度为300的磷酸缓冲液中, 于25?避光下 ƒN GT Λgm l () 分不同时间 30′, 60′, 90′等处理. 最后, 用大量缓冲液稀终止反应. 离心, 再稀释, 挑单细胞 点接帄板分纯突变体. 挑选单菌落编号, 移接斜面培养, 冰箱保存备用. 经初筛和复筛, 在致死率为65. 85, 76. 23% 的处理中获得96, 113, 124, M u n M u n M u n 141和个菌株, 经多次摇瓶考查, 传代试验, 证明 较其他菌株及对照 266 5141M u n M u n M u n () 株 优良且性能稳定.M aA # 1. 6 37固体培养基筛选 # 安络小皮伞为野生药用真菌, 选用多种富含纤维素和木质与1固体培养基素的天然材 # # () 料为主要碳源, 配以氯源和无机盐, 新配制13种 2, 4综合固体培养基, 经比较, 筛选 出 # 7固体培养基. 1. 7 放大试验 # # 菌株经7固体斜面培养基扩大, 进行30 发酵罐批量放大试验与1固体培养 141M u n t 基. 2 结果与讨论 # # 2. 1 菌株在7固体斜面培养基上生长较1固体斜面培养基菌丝萌发早16- 2. , 141M u n h 生长速度快, 色泽纯正, 浓密, 与试管壁紧贴而不干缩, 菌丝生长量增加5, 7%. 2. 2 141和菌株分别进行6批次摇瓶发酵试验, 每株每批二级发酵500三角瓶M u n M aA m l (()) 18个, 共108个. 发酵结束测定发酵液 值. 菌丝干重 ƒ氯仿提取物含量 % . 计算结 , pH g L ( 果 列 于 下 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf .显 示 摇 瓶 发 酵 总 帄 均 氮 仿 提 取 物 含 量 为 10. 8446% 标 准 差 ? 49.141 M u n ) () ( )45% , 对照株 为 7. 5324% 标准差?265. 34. 二者相比, 较 提高了43. M aA M u n M aA 97%. 141菌株在漯河市第一制药厂安络痛车间用30 发酵罐进行40罐次放大试验, 测 M u n t ( )定结 果, 氯 仿 提 取 物 含 量 最 高 达 18. 79% , 帄 均 为 12. 38% 标 准 差 ? 45. 38 . 而 原 菌 株 () () 当月在该车间的帄均氯仿提取物含量为8. 24% 标准差?216. 32, 显示较141M aA M u n 提高50. 24%., M aA 安络小皮伞摇瓶发酵产物含量2. 3 安络小皮伞为野生真 菌丝干重氯仿提取物菌, 其担孢子较难获得, 加之 值 最终 菌株试验批号pH ( )含量 % ()ƒgL 担孢子壁厚, 对诱变剂敏感 2- 5 3. 03 4. 0214 6. 9175 性差, 考虑到真菌菌丝的生 2- 8 2. 89 5. 2823 7. 7658 长点在菌丝顶端, 细胞核位 2- 9 2. 95 5. 9023 8. 5644 4 于菌丝亚顶端部分, 所 以 M aA 3- 6 2. 92 5. 2315 7. 5644 选用新生菌丝片段进行诱变 3- 9 3. 05 4. 0112 6. 8705 处理. 菌丝片段可能是单细 3- 10 3. 02 5. 1214 7. 5117 胞, 双细胞或多细胞. 只有单 4. 9284 7. 5324 x 细胞菌丝片段产生的正突变 2- 11 8. 6242 10. 9504 形成的菌落才是纯菌落, 遗 2- 14 8. 6318 10. 9526 传性状才稳定. 为此, 诱变后 2- 15 7. 7226 10. 9989 采用单细胞分离法获得突变 3- 12 9. 4925 11. 0135 M un 141 体. 2. 4 考查安络小皮伞的系 3- 15 9. 5078 11. 032 谱, 目前生产上使用的M aA 3- 16 9. 6037 10. 1203 菌株未经任何诱变处理, 故 8. 9304 10. 8446 x 采用较常用的 和 U V N T G 复合处理, 取得明显的诱变效果. 对于诱变剂量, 过去多采用高剂量, 致死率90, 99% , 甚至 8 99. 9% , 认为高剂量虽然负突变多, 但在少数正突变中 , 产量提高的幅度大. 近年来主张 采用低剂量, 致死率70- 85% , 甚至更低, 认为正突变多出现在低剂量区域. 本研究中, 优良 () 菌株均在较低剂量 致死率在65- 80% 之间范围内获得. 2. 5 摇瓶及放大试验的各项数据, 均在老工艺条件下获得. 筛选的菌株如能在最 141M u n 佳条件进行发酵, 可能会表现出更好的生产性能. 有待进一步研究. 2. 6 安络小皮伞的发酵产物安络痛, 其有效成分不明确, 目前生产上测定氯仿提取物含量 的方法繁琐且准确性差, 急待解决. 参 考 文 献 1 . . L ingdebe rg GU be r d ie p h y sio lo g ie L ign inabbauende r Bo denh y m enom yze ten Sym bo lae Bo tanU p 2 () 8 2: 1- 183sa lien se s 2 , . , 1969, 21: 708L e igh J M Co ldw e ll A D SJ p h a rm acy and p h a rm co lo gy 3 戴芳澜. 中国真菌总汇. 北京: 科学出版社, 1979, 532- 534 4 周与良等. 真菌学. 北京: 高等教育出版社, 1986, 40- 44() 5 广东微生物研究所. 微生物学报. 1975, 15 3: 188- 190 6 朱绍雄等. 中草药. 1988, 8: 2- 3 () 7 广东微生物研究所. 微生物学报. 1976, 16 1: 28- 32 8 章名春. 工业微生物诱变育种. 北京: 科学出版社. 1984 () 9 陈西广等. 真菌学报, 1990, 9 2: 155- 160 10 广东微生物研究所. 中草药通讯, 1975, 5: 38- 40 141Se lec t ive Breed in g of M ara sm is an dro sacceus M un a a b c cL i Zho ngy iN ie Guo x ingSun X inYanW ang A ilingL i Yaq ing (. , 453002, , . . aH enan N o rm a l U n ive r sityX inx ingbL uo h e F ir st P h a rm aceu t ica l F ac to ry ). cT h e A g r icu ltu ra l B u reau o f th e C ity o f A n Yang 141 A bstra c t A M o r ra sm is and ro sacceu s M un w ith h igh p ro duc t io n w a s sc reened af te r t rea tm en t o f , , . sep a ra t io np u r if ica t io n and m u tagen izeand w ith th e m e tho d o f liqu id fe rm en ta t io nIn th e exp anded exp e r i2 (?45.30 , 12. 38% m en t o f to n’ s fe rm o n tan t ja rit s m ean ch lo rfo rm p ro duc t io n can be S tanda rd dev ia t io n ) () 38% 50. 24% , . w h ich w a s h igh e r th an th a t o f co n t ra st t ra in M aA and it s p e rfo rm ance is steadyT h e # 7141 . , 141, su itab le so lid m ed ium fo r g row th o f M un w a s a lso sc reenedO n th is m ed ium p yp h ae o f M un can , , , 5-sp ro u t ea r lyg row qu ick ly and it s m yce lium is stu rdy and den seit s co lo r is p u reit s g row th ra te w a s # 7% 1.h igh e r th an th a t o f m ed ium ; ; , Key word s M a ra sm is and ro sacceu sliqu id fe rm en ta t io nm u tageu izesc reen ing () 上接第66页 参 考 文 献 1 金斗满, 朱文祥著. 配位化学研究方法. 北京: 科学出版社, 1996. 336() 路国梁, 宋福金等. 无水无氧实验技术. 化学通报, 1993, 10: 48 2 () , . . , 1966. 1P e r r in D D e ta lP u r if ica t io n o f L abo ra to ry C h em ica lsP e rgam o n P re ss O xfo vd 3 ( ) , . - - I Yang L ine t a lP rep a ra t io n and X ray st ruc tu re s o f go ld com p lexe s w ith som e f luo ro p ho s2 4 )(, . , 1992, 29: 887p ho ru s L igand sE u r J So lid S ta te lno rg C h em 5 , . - - 8- Yang L in e t a lSyn th e se and C h a rak te r isie rung vo n H a lo genp ho sp ho rD e r iva ten de s H yd ro xy - ch ino lin s. Z N a tu rfo r sch , 1993, 18b: 85 () () () (), . - 1, 2- - , - , 6 Jo ne s P Ge t a lc isD ich lo ro v ing lb is d im e th y lg lyo x im a toN N ’P y r id ineN Co ba lt , , 1996, 52: 2399C h lo ro fo rm So lva teA c ta c ry stC - The M e thod s of Prepa r in g S in g leCry sta l Yang L in F eng M e iy in L i H o ngx ing J iang Ka i (), 453002, H enan N o rm a l U n ive r sityX inx iang - - -A bstra c t T h e m e tho d s o f p rep a r ing sing lec ry sta l unde r th e co nd it io n o f no n w a te r and no n . - , - o xygen a re repo r ted in th is p ap e rT h e m e tho d s inc lud L iqu id d iffu sio nga so ue sd iffu sio n and tem p e ra2 . tu re reduc t io nT h e exp e r im en t ind ica te s th a t th e se m e tho d s h ave exce llen t affec t and C an be u sed to p re2 - .p a re th e sing lec ry sta l o f th e com po und s w h ich a re in sen sit ive to a tm o sp h e re - ; ; Key word s sing lec ry sta lp rep a ra t io nm e tho d