一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株P5W及应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112592873A(43)申请公布日2021.04.02(21)申请号202110234519.6(51)Int.Cl.(22)申请日2021.03.03C12N1/20(2006.01)A61K39/02(2006.01)(83)生物保藏信息A61P31/04(2006.01)CGMCCNo.211542020.11.11C12R1/63(2006.01)(71)申请人山东省海洋资源与环境研究院（山东省海洋环境监测中心、山东省水产品质量检验中心）地址264006山东省烟台市开发区长江路216号(72)发明人韩慧宗　王腾腾　姜海滨　陈钰臻　王斐　张明亮　李斌　崔广鑫　杜文勇　(74)专利代理机构北京中济纬天专利代理有限公司11429代理人马国冉权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株P5W及应用(57)摘要本发明提供了一种许氏平鲉强致病菌哈氏弧菌菌株P5W及应用；菌株P5W对许氏平鲉具有极强的致病力，该菌株P5W保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21154，保藏日期为2020年11月11日，分类命名为哈氏弧菌Vibrio harveyi。本发明实施例所涉及的哈氏弧菌P5W对许氏平鲉具有较强的的致病力,能够引起许氏平鲉肝、脾、肾和肌肉出现不同程度的病变，在较短时间内造成鱼体发病或死亡，而且还可以用于许氏平鲉抗哈氏弧菌苗种的选育和许氏平鲉哈氏弧菌疫苗的制备。CN112592873ACN112592873A权　利　要　求　书1/1页1.一种许氏平鲉强致病菌哈氏弧菌菌株P5W，其特征在于，菌株P5W对许氏平鲉具有极强的致病力，该菌株P5W保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏日期为2020年11月11日，保藏编号为CGMCC NO.21154，分类命名为哈氏弧菌Vibrio harveyi。2.如权利要求1所述的菌株P5W的应用，其特征在于：用3×108CFU/mL浓度的活菌液注射许氏平鲉，实验动物在极短时间内发病死亡。3.如权利要求1所述的菌株P5W的应用，其特征在于：用于选育许氏平鲉抗哈氏弧菌苗种和制备许氏平鲉哈氏弧菌疫苗。2CN112592873A说　明　书1/4页一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株P5W及应用[0001] 技术领域[0002]本发明属于微生物领域；尤其涉及一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株P5W及应用。[0003]背景技术[0004]哈氏弧菌为革兰氏阴性菌, 属弧菌目(Vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio), 广泛分布于海洋环境中。哈氏弧菌是导致水产养殖动物爆发弧菌病的重要病原菌, 对养殖业健康发展产生很大的影响, 已有报道哈氏弧菌能引起许氏平鲉（Sebastes schlegelii）、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、牙鲆(Bastard halibut)、美洲黑石斑鱼(Centropristis striata)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei), 金头鲷(Sparus aurata)等患病甚至死亡。哈氏弧菌侵染鱼体后分泌一些胞外产物，如胞外蛋白酶、溶血素、细胞毒素等，会导致机体肝脏、肾脏、脾脏、肌肉、胸腺、肠道等组织发生病变或坏死, 影响宿主相关组织器官正常功能的维持和发挥, 从而引发宿主发病甚至死亡。哈氏弧菌疾病的频繁发生给养殖生产造成较大的经济损失，制约了养殖产业的健康发展。抗生素的使用有效的解决细菌感染问题，但大量使用抗生素会增加细菌耐药性，破坏养殖动物体内的正常菌群，引起动物体内的微生态内环境失衡，从而导致动物内源性感染或二重感染以及动物免疫功能的下降，更重要的是大量使用抗生素会造成药物残留，严重影响水产品等的食用安全，危及人类健康。培育优质抗病苗种、开发病原疫苗、使用微生态制剂、加强科学精细化饲养等措施成为养殖病害防控的新思路。本专利申请人从患病许氏平鲉病灶处分离出一株特征明显的致病菌哈氏弧菌，该菌株对许氏平鲉具有强致病力，用3×108CFU/mL浓度活菌液注射许氏平鲉，会造成许氏平鲉在极短时间内发病死亡。因此，利用该菌株开展许氏平鲉抗哈氏弧菌苗种的选育和许氏平鲉哈氏弧菌疫苗的制备，可以有效的防控哈氏弧菌疾病的发生，促进养殖产业的绿色健康发展。[0005]发明内容[0006]本发明的目的是提供了一种许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株P5W及应用。[0007]本发明是通过以下技术 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 实现的：本发明涉及一种许氏平鲉强致病菌哈氏弧菌菌株P5W，菌株P5W对许氏平鲉具有极强的致病力，该菌株P5W保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏日期为2020年11月11日，保藏编号为CGMCC NO.21154，分类命名为哈氏弧菌Vibrio harveyi。[0008]本发明还涉及前述的许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株P5W的应用，本发明所涉及的哈氏弧菌菌株P5W，分离自患病许氏平鲉病灶处，用3×108cfu/ml的活菌液注射许氏平鲉，3CN112592873A说　明　书2/4页可在极短时间内致其发病死亡，证实该菌对许氏平鲉具有强致病力。[0009]本发明还涉及前述的许氏平鲉致病菌哈氏弧菌菌株P5W的应用，用于选育许氏平鲉抗哈氏弧菌苗种和制备许氏平鲉哈氏弧菌疫苗。[0010]本发明具有以下优点：（1）本发明所涉及的哈氏弧菌菌株P5W对许氏平鲉具有强致病力；（2）本发明所涉及的哈氏弧菌菌株P5W可作为材料来选育许氏平鲉抗哈氏弧菌苗种和制备哈氏弧菌疫苗，用于养殖生产可减少弧菌类疾病的发生，提高养殖经济效益，促进养殖产业绿色健康发展。[0011] 附图说明[0012]图1本发明所涉及的哈氏弧菌P5W在LB琼脂培养基上的菌落形态图；图2本发明所涉及的哈氏弧菌P5W胞外产物溶血性及酶活性检测结果图；其中，a.溶血素; b. 蛋白酶; c. 脂肪酶; d. 卵磷脂酶; e. 淀粉酶; f. 尿素酶; g. 明胶酶；图3为本发明所涉及的菌株P5W对许氏平鲉的侵染的组织病理学观察结果图；其中，a.健康许氏平鲉肝脏；b.患病许氏平鲉肝脏肝细胞呈明显空泡化，细胞核变大；c.健康许氏平鲉脾脏；d.患病许氏平鲉脾脏含铁血黄素沉积，血细胞弥漫；e.健康许氏平鲉肾脏；f.患病许氏平鲉肾小管部分上皮细胞脱落、坏死，肾小球萎缩；g.健康许氏平鲉肌肉；h.患病许氏平鲉肌纤维出现断裂、坏死现象。[0013]具体实施方式[0014]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。实施例[0015]本实施例涉及采用的菌株为许氏平鲉强致病菌哈氏弧菌菌株P5W，分离自患病许氏平鲉病灶处，该菌株P5W保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21154，分类命名为哈氏弧菌Vibrio harveyi，保藏地址为中国北京，保藏日期为2020年11月11日。[0016]、菌株的制备在无菌条件下，用无菌解剖刀刮取患病许氏平鲉肌肉溃烂处组织，加入到无菌生理盐水中，涡旋振荡摇匀，用接种环蘸取混合液，在LB固体培养基上划线培养，见图1所示。挑取优势菌单菌落重复划线培养3次，挑取单菌落30℃扩繁后保种于终浓度15%的甘油中。通过纯化筛选，获得一株特征明显的优势菌，即本发明所述许氏平鲉强致病菌哈氏弧菌菌株，命名为P5W。[0017]、菌株的鉴定采用常规细菌总DNA提取方法对优势菌株P5W的DNA进行提取，用16S rDNA通用引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和GGCTACCTTGTTACGACTT扩增16S rDNA片段，扩增产物经检测后4CN112592873A说　明　书3/4页送至生工生物工程（上海）股份有限公司青岛测序实验室进行测序。测序结果采用BLAST软件与GenBank核酸数据库中所收集的相关种属的16S rDNA序列进行同源性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。经比对分析，P5W与Vibrio harveyi亲缘关系较近，因此将P5W命名为哈氏弧菌Vibrio harveyi P5W。[0018]、菌株的致病力检测（1）胞外产物溶血性及酶活性分析将菌株P5W分别接种到溶血素、蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、尿素酶、明胶酶鉴定培养基中, 28℃培养24 h后观察菌落周围是否产生明显的显色圈。结果显示溶血素活性检测发现菌落周围出现透明的溶血圈(图2a)，表明菌株P5W胞外产物含有溶血素，对绵羊血具有较强的溶血性；蛋白酶活性检测菌落周围出现透明区环(图2b)，表明菌株P5W胞外产物含有蛋白酶，能够分解组织蛋白；脂肪酶活性检测菌落周围出现白色沉淀带(图2c)，表明菌株P5W胞外产物含有脂肪酶，能够分解脂质；卵磷脂酶活性检测菌落周围出现透明区环(图2d)，表明菌株P5W胞外产物含有卵磷脂酶，能够分解卵磷脂；淀粉酶活性检测菌落周围培养基变透明(图2e)，表明菌株P5W胞外产物含有淀粉酶，能够分解糖原物质；尿素酶活性检测菌落周围呈红色(图2f)，表明菌株P5W胞外产物含有尿素酶，能够分解尿素产生NH3, 在菌体周围形成碱性环境；明胶酶活性检测菌落周围出现透明区环(图2g)，表明菌株P5W胞外产物含有明胶酶，能够分解组织蛋白。结果表明P5W胞外产物具有蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、尿素酶及明胶酶活性。菌株P5W胞外酶协同作用能够溶解鱼体各种细胞, 破坏鱼体相关组织, 最终导致宿主患病甚至死亡。[0019]（2）菌株P5W对许氏平鲉的人工感染实验将哈氏弧菌P5W在28℃培养24 h, 离心收集菌体, 使用无菌PBS缓冲液清洗菌体, 梯度稀释分别制成3×108、3×107、3×106、3×105和3×104 CFU/mL的菌悬液。人工感染实验共分成6组，其中5个实验组和1个对照组, 每组有体重(65.02±16.52) g的实验鱼18尾, 分3个平行。实验组分别腹腔注射0.2 ml不同浓度的菌液, 对照组注射等量的无菌PBS缓冲液。实验结果如表1所示，菌株P5W对许氏平鲉具有较强的致病力，感染许氏平鲉幼鱼实验持续7天, 3×108 CFU/mL浓度感染下，实验鱼全部死亡时间不足2天，实验结束时，3×107 CFU/mL组、3×106 CFU/mL组和3×105 CFU/mL组的累计死亡率分别为78%、33%和11%；P5W 对6许氏平鲉的半致死浓度LD50为 5.7×10 CFU/mL。[0020]表1（3）菌株P5W对许氏平鲉侵染的组织病理学观察分别取健康与患病许氏平鲉的肝、肾、脾和肌肉组织进行组织切片的制作、观察和5CN112592873A说　明　书4/4页分析。结果显示健康许氏平鲉组织结构完整，未见病变；患病许氏平鲉可见肝脏、脾脏、肾脏、肌肉组织出现不同程度的病变。健康许氏平鲉肝脏细胞完整、排列紧密(图3a), 患病鱼肝脏细胞间界限模糊, 肝细胞呈明显空泡化, 肝细胞萎缩, 细胞核变大, 胞内物质颜色加深(图3b); 健康许氏平鲉脾脏细胞排列规则紧密(图3c), 患病鱼脾脏出现较多空隙, 含铁血黄素沉积, 淋巴细胞减少, 血细胞弥漫(图3d); 健康许氏平鲉肾单位结构清晰, 肾小球、肾小管结构完整, 细胞规则整齐(图3e), 患病鱼肾小管管腔变窄, 部分上皮细胞脱落、坏死, 肾小球萎缩, 肾间质中出现较多空泡(图3f); 健康许氏平鲉肌节分明、排列紧密(图3g), 患病鱼肌纤维结构松散, 出现断裂、坏死现象(图3h)。[0021]有上述表述和数据可以证明：本发明实施例所涉及的哈氏弧菌P5W 对许氏平鲉具有较强的的致病力, 能够引起许氏平鲉肝、脾、肾和肌肉出现不同程度的病变，在较短时间内造成鱼体发病或死亡，而且还可以用于许氏平鲉抗哈氏弧菌苗种的选育和许氏平鲉哈氏弧菌疫苗的制备。[0022]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。6CN112592873A说　明　书　附　图1/1页图1图2图37