反义核酸药物

反义核酸药物一、概述1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来特异性地抑制基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的设想。1978年，Zamecnik和Stephenson利用一段长13个碱基的反义DNA寡核苷酸链成功地抑制了劳斯（Rous）肉瘤病毒的复制，引起人们极大的关注。1981年Tomizawa第一次报道了天然反义RNA的生物学功能，发现在质粒DNA复制时，与引物RNA互补的RNA分子能抑制DNA复制。1983年Mizuno和Simon等同时发现反义RNA的调节作用，进而揭示了一种新的基因表达调节机制。20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，反义核酸的研究快速发展起来。有人将它与20年前单克隆抗体的问世相比拟，认为该项技术的成熟化有望获得一类可以“根治”肿瘤、遗传性疾病、病毒性疾病等多种疑难杂症的新型药物。反义技术正孕育着药物学和药理学上的一次革命。反义核酸：是指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之特异性结合的一段DNA或RNA。一般包括:反义DNA（antisenseDNA）反义RNA（antisenseRNA）核酶（ribozyome）:是具有酶活性的RNA，主要参加RNA的加工与成熟。反义寡聚核苷酸（antisenseoligonucleotides，asON）：目前研究的热点。是一小段与mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的短核酸片断。反义核酸技术：是指利用反义核酸的特异性来抑制某些基因表达技术。反义药物：利用这一技术研制的药物。反义核酸可特异性地作用于靶基因或mRNA，从基因复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上调控基因的表达，从而实现疾病的治疗。药物的研究与开发取决于两个重要的参数：1、确定疾病发展过程中的合适靶点；2、发现能特异性识别并能与该靶点结合的化合物，从而干预疾病的发展过程。反义寡核苷酸作为药物比常规药物的治疗有更高的特异性。1、有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设计、合成特异性的反义核酸比较容易；2、反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特异和有效的结合，从而调节基因的表达。缺点是：天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入又容易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。为此，人们采用药物化学的原理和方法，对天然寡核苷酸进行化学修饰，以达到治疗药物的要求。国外已有反义药物应用于临床,Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志1998年7月报道了第一个通过ＦＤＡ认证的反义药物,即用于治疗艾滋病人巨细胞病毒感染的视网膜炎的福米韦生(Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ,Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ),这是ISIS公司的一大成果,此外还有多种反义药物包括核酶在内的新一代反义药物进入临床。二、反义药物的作用机理反义核酸可在复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上发挥调控作用。其机制为：1、在DNA复制水平上：反义RNA可作为DNA复制的抑制因子，它可与引物RNA互补结合，抑制DNA的复制，从而控制复制频率。例如：大肠杆菌质粒Pmb1(ColE1)复制是通过RNAI（反义RNA）实现抑制作用。该质粒复制起始时，引物(RNAII)与其模板链结合，并在DNA聚合酶参与下合成新的DNA子链。但是很快就有一种长约100个核苷酸的反义RNA分子(RNAI)生成。RNAI与RNAII-552----447核苷酸互补,且互补区位于复制起始位点上游,它在ColE1复制过程中能与RNAⅡ的5’-末端互补结合，使其构型改变，从而阻碍了RNAⅡ与DNA模板链的结合，RNAⅡ不再起到引物的作用，质粒DNA的复制终止。见图示：ColicinImmunityProteinRNAIIRNAIOriginColE1(6646bp)ReplicationoftheColE1PlasmidColE1replicationisunidirectionalRepliconColicin2、在转录水平上：反义RNA可与mRNA5’-端互补,从而阻止了RNA的完整转录。大肠杆菌的cAMP受体蛋白基因（CRP)的转录会受到一种小分子反义RNA的制约。这种反义RNA可与CRP基因转录起始生成的mRAN分子的5’-端序列互补，形成特异的二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄-环结构，空间构象障碍迫使RNA聚合酶脱离DNA模板，停止转录。3、在翻译水平上（主要调控形式）：主要表现在三个方面：1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno，SD序列）序列结合，直接抑制翻译；2、二是与mRNA5’-端编码区，主要是起始密码AUG结合，抑制翻译起始；3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的翻译。GGAGG1、作用于mRNA5’-末端，阻止帽子结构的形成；2、作用于外显子和内含子的连结区，阻止前体mRNA的剪接；3、作用于PolyA形成位点，阻止mRNA的成熟及向胞浆的转运；4、与mRNA结合，使得mRNA易被酶识别而被降解，从而使蛋白质的表达受到抑制。真核细胞中反义RNA除了上述三个水平发挥作用外，在下列阶段也呈现功能：核酶(Ｒｉｂｏｚｙｍｅ)技术核酶是一类本身具有酶的剪切活性的ＲＮＡ,也是反义技术的一部分,它能序列特异地催化切割靶ＲＮＡ,故也可用来封闭ＲＮＡ的功能。核酶的作用原理为核酶的特异性序列通过互补碱基对形成识别并结合特异性靶ＲＮＡ,故可以人工设计针对某一靶ＲＮＡ的核酶,破坏靶ＲＮＡ。近来还有人将多个不同的核酶连接在一起使切割效率大大提高,已试用于临床,其治疗范围也已从单基因疾病扩大至多基因疾病。另外,在核酶基础上,人们又提出了反义核酶的概念,即通过基因连接将反义ＲＮＡ与核酶的基因连为一体,再转录得到具有双重功能的一类ＲＮＡ分子,对靶基因既有封闭作用,又有切割作用。目前核酶在基因治疗领域中颇受瞩目,属研究热点。核酶药物　近年来利用反义核酸和核酶进行抗病毒治疗已有进展。将核酶基因以合适的载体导入细胞内，在细胞内转录产生核酶，从而发挥抗病毒作用。　　　　反义RNA调节翻译的基本原理是：1、反义RNA与mRNA有互补序列，根据碱基互补原则，能相互结合，形成mRNA-反义RNA杂交体，阻断mRNA的翻译。2、反义RNA和mRNA的结合可发生在细胞核中，也可发生在细胞质中。如发生在核中，就会干扰mRNA的加帽和加尾以及剪接和加工过程，也会干扰mRNA从细胞核向细胞质的转运。3、RNA杂交分子不稳定，易被核酸酶降解。4、反义RNA与胞质中成熟的mRNA杂交，抑制其翻译成蛋白质。特点选择性强:asON只作用于靶基因,不与非相关基因作用,特异性高，且片断短,合成方便、经济;效率高:asON几乎可以完全阻断靶基因的翻译;低毒:asON作用于局部,对全身影响小。三、反义药物的特点,设计和导入方法反义核酸药物是药理学的新领域或革命:新的药物——反义寡核苷酸新的药物受体——　mRNA新的受体结合方式——Watson-Crick杂交新的药物受体结合后反应:（1）RNaseH介导的靶RNA的降解；（2）抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。设计能特异地识别靶基因,并能与之稳定结合;有较长的半衰期及较强耐受核酸酶消化的能力;能通过靶细胞膜,有效的到达作用部位。导入方法1、RNA病毒感染;2、脂质体包裹反义寡核苷酸；3、显微注射;4、逆转录病毒;5、腺病毒介导等方法。此外,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加asＯＮ到达靶细胞的能力。四、反义核酸类药物必需符合的条件1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此,只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反义ＤＮＡ/ＲＮＡ序列。这些区段主要包括:5′端帽子结构区;ｍＲＮＡ的起始编码区或编码区;核前体ｍＲＮＡ的拼接区;反转录病毒的引物区等。这些区段均为基因表达的关键区或敏感区,对基因的调控起重要的作用。一般而言,只要人工设计合成15----20个碱基长度的反义ＤＮＡ或反义ＲＮＡ,就足以使此反义核酸与靶ｍＲＮＡ形成结合作用,且这种结合调节是非常特异性的。2、稳定性(ｓｔａｂｉｌｉｔｙ)asON的功能在很大程度上取决于其稳定性,asOD在体内生理条件下,很容易被各种核酸酶降解,这样就根本无法达到阻遏ｍＲＮＡ翻译的目的。因此,人们对反义核酸的结构进行各种化学修饰以提高其稳定性,增加对核酸酶的抗性。碱基是asON与靶基因通过氢键形成而直接接触的部位,而氢键的形成又是asON发挥功能的必要条件。因此,该部位的修饰应以不影响氢键形成为前提。任何影响A-T（U）/G-C碱基配对的修饰都会因碱基错配而导致asON与靶基因的结合或特异性降低或丢失。如：1、在胞嘧啶的5位点甲基化（最常使用）2、使用三氟甲基、咪唑丙基、炔丙基等。（1）碱基修饰：DNAchain-CH3（2）骨架修饰第1条途径-------磷的修饰:磷原子是核酸酶的主要攻击位点,修饰后效果明显。磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代磷酸寡核苷酸(phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN)最为常用,称为“第一代反义药物”。PS-ODN是至今研究最深入、应用最广泛的一类asODN，它有效增强了对核酸酶稳定性、具有良好的水溶性及易于大量合成，基本能满足临床治疗的需要。PS-ODN与天然ODN相比：通过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长最终细胞内浓度也更高；t1/2一般都大于24h，极大的提高了对核酸酶的耐受力；但由于PS-ODN其本身带有大量的负电荷，能与多种因子结合从而导致非特异效应。在体内表现出剂量依赖的毒副作用。第2条途径------糖环修饰:糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’-3′连接、5’＿5′连接等。原理是使核酸酶不能有效识别磷酸二酯键。α构型修饰:是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。1’位取代、2’位取代:指将戊糖的1′2′位引入某些取代基。如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功能分子后,也使asＯＮ具备更强的核酸酶抗性，但不影响亲和力。3′＿3′5′＿5′连接修饰:考虑到核酸酶只识别3′,5′磷酸二酯键,故合成一类具有3′＿3′5′＿5′颠倒连接末端的asON(ＩＮＶ＿asON),结果使核酸酶不能识别。第3条途径-----肽骨架基于asON发挥特异性抑制基因表达的关键在于其碱基排列顺序,而与易于降解的磷酸和糖环组成的磷酸二酯键骨架无关。所以,asOD的磷酸-糖骨架以肽键取代，得到新型的化合物----多肽核酸(ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ,ＰＮＡ)。由于结构上PNA与DNA类似，其两相邻碱基间距及碱基与类肽链骨架间的距离均相近，PNA与DNA以及RNA与PNA之间均可形成碱基配对。假肽取代磷酸二酯键后其：特异性更强，带电荷少、不被蛋白酶和核酸酶识别,亲和性更高,副作用减少。具有比前两代反义寡核苷酸更好的亲和力和至少相同的序列特异性，而且也有相当的抗病毒活性。称为第三代反义核酸。近来这种肽核酸研究很多。即综合应用多种化学修饰,效果很好,有“第二代反义药物”之称。它以PS-ODN为核心，两翼序列上的核糖的2’位被其它基团修饰。除了化学修饰，还可以试作转基因表达反义核酸，在体细胞内以DNA为模板转录产生,模拟天然ＲＮＡ的形成过程,这样表达的反义ＲＮＡ可能在细胞内被天然修饰,从而稳定性得到提高。第4条途径----构建嵌合体结构的反义核酸3、溶解性(ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ)从反义核酸的作用原理来看,它必须溶解于水且又能透过细胞膜,进入细胞中才能与ｍＲＮＡ发生作用。故asON的水溶性与脂溶性必需有一个恰到好处的平衡。由于asON带负电荷且有较强的亲水性,因此不易与带同样电荷的靶细胞接触,更不易透过由脂质双分子层构成的细胞膜进入细胞内。化学修饰是解决这一问题的有效手段,修饰途径包括引入亲脂性基团和改变其负电性等。五、反义药物的临床应用asON能通过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒的关键编码基因来特异性抑制肿瘤细胞增殖和病毒的复制，是治疗肿瘤和病毒性传染病的潜在新型药物。1、在癌症方面的应用反义核酸技术特异性抑制癌基因的表达,进而抑制肿瘤细胞增殖已取得极大的成功。已完成Ⅱ期临床的ＰＫＣα(蛋白激酶Ｃ)反义化合物(ＩＳＩＳ3521),可使卵巢癌患者的盆腔肿瘤块消退。在Ⅰ期临床试验中可使结肠癌患者的癌胚抗原(ＣＥＡ)维持稳定。预计在不久的将来,针对各种癌基因和生长因子的反义药物将陆续投放市场,为肿瘤的治疗提供一条新的分子靶向途径。近年来,反义药物应用于抗癌研究又涉及到新的领域。研究发现,浸润和转移是恶性肿瘤的生物学特性。文献认为乙酰肝素酶与黑素瘤细胞潜在性转移相关连,神经生长因子(ＮＧＦ)或神经性营养因子3(ＮＴ3)不仅增加黑素瘤细胞乙酰肝素酶生成,而且有力促进其基质胶渗入。以黑素瘤细胞Ｐ75ＮＴＲ(Ｐ75抑癌基因ＮＴ受体)ｍＲＮＡ为反义靶点,反义ＯＤＮ能降低ＮＴ3与Ｐ75ＮＴＲ结合和基质胶渗入,达到抑制黑素瘤细胞的浸润。同时,研究还发现,肿瘤的生长和转移均依赖于血管生成,而血管生成早期一个关键步骤就是激活的内皮细胞产生尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(ｕＰＡ)。Ｆｉｂｂｉ等应用反义ｕＰＡＲ(ｕＰＡ受体)ｍＲＮＡＯＤＮ拮抗ｕＰＡ与ｕＰＡＲ结合后的血管生成转换,进而抑制葡萄糖的吸收、二酰基甘油(ＤＡＧ)的合成,ＰＫＣ的活化,有效阻滞内皮细胞的增殖和化学趋化性、化学浸入。2、在抗病毒方面的应用　目前还难以找到特异性的抗病毒药物,反义药物的出现,如治疗人免疫缺陷病毒的ＧＥＭ91、Ｇｐｓ0193、ＡＲ177,人乳头瘤病毒的ＩＳＩＳ2195等,为解决抗病毒药物特异性的问题提供了有力的武器。反义药物福米伟生(ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ)已完成新药应用(ＮＤＡ)登记,成为第一个获得美国食品与药物管理局(ＦＤＡ)批准治疗艾滋病相关巨细胞病毒(ＣＭＶ)的反义药物。根据文献提供的ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ治疗ＣＭＶ视网膜炎的研究结果表明,ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ能显著延缓ＣＭＶ视网膜炎的病情进展,18名接受ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ治疗(每周玻璃体内给药一次,连续三周,然后隔月给药)患者病情进展平均时间为71ｄ,而对照组为14ｄ。常见的不良反应是眼内压升高(18.5%),轻至中度可逆转的眼内炎症(15%)。由于反义ＯＤＮ为多聚阴离子,具有不易透过细胞膜,细胞难于吸收,胞内积累较少的缺点。如何增加反义ＯＤＮ的细胞吸收,增加其抗病毒活性,成为许多学者研究的重点。在人肠癌细胞,文献验证了与含肠冠状病毒基因间同感序列的峰形蛋白ｍＲＮＡ起始编码区完全互补的18聚反义ＯＤＮ抗病毒活性:1.磷酸二酯ＯＤＮ病毒抑制率为12%～34%,2.经修饰的硫代磷酸以β环糊精衍生物为载体的磷酸二酯ＯＤＮ病毒抑制率分别为56%～90%和90%,为提高反义ＯＤＮ抗病毒活性提供了有效途径。3、在心血管方面的应用　以去唾液酸糖蛋白(ＡＳＯＲ)载体分子偶合的反义ＯＤＮ与胆固醇喂养的兔动脉粥样硬化间的关系。结果显示：注射反义ＯＤＮ的兔与对照组和有义ＯＤＮ(ｓｅｎｓｅＯＤＮ)相比较,不仅胆甾型酯转移蛋白(ＣＥＴＰ)ｍＲＮＡ减少和低密脂蛋白(ＬＤＬ)受体ｍＲＮＡ增加,而且主动脉胆甾醇含量及主动脉表面积病变百分率显著减低,有效抑制主动脉粥样硬化的发展。用ＥＲＫ1(胞外信号调节激酶)和ＥＲＫ2反义ＯＤＮ减少ＥＲＫ蛋白的表达(83%和75%),从而反义抑制油酸和血管紧张素Ⅱ所致协同的有丝分裂反应,缓解肥胖性高血压患者的血管平滑肌病变。六、反义药物的给药途径最初的反义药物是采用局部注射给药。最新的临床前研究表明,反义寡核苷酸药物经修饰可制成不同制剂,包括口服制剂,扩大了其治疗应用范围。处于临床试验的第一代反义药物均是通过静脉输注或皮下和眼玻璃体注射给药,临床资料表明,这种给药方式可使药物直达作用靶位。来自ISIS和Hybridon两家公司的临床前研究显示,反义寡核苷酸经肠道吸收、透皮和吸入等途径给药安全有效。研究人员采用在体肠道再灌注模型,发现通过改变寡核苷酸化学结构以及使用渗透促进剂,可使药物的生物利用度达到15%～20%,非常接近口服的生物利用度,这说明口服反义药物是可行的。透皮吸收亦为一有效的给药途径,临床前研究显示,以乳膏剂型局部应用反义化合物,可在表皮或真皮形成达治疗浓度、具药理活性的寡核苷酸层。此外,通过变更药剂组成,可改变寡核苷酸所到达的皮肤部位,这对用于不同疾病至关重要。在鼠和猴的试验中,采用吸入方式给以硫代磷酸寡核苷酸药物,随后便在血浆和某些器官发现了原型寡核苷酸,这表明此给药方式能达到全身性释药效果。基于这些研究结果,ISIS公司希望其反义药物ISIS-2302在进行Ⅱ期临床实验时,能用其灌肠制剂治疗溃疡性结肠炎,用其吸入制剂治疗哮喘,用其外用制剂治疗牛皮癣。INEX公司专门研制开发了寡核苷酸的脂质体产品,便于口服,且可避免核酸酶的降解作用及与血浆蛋白的结合。INX-6295是一种抗c-myc基因(存在于多种恶性肿瘤,包括黑色素瘤、肺、乳腺和结肠直肠癌)的脂质体包囊型反义药物,体外研究显示:它与阿霉素联用具抗肿瘤活性。　七、反义核酸技术存在的问题和展望1.存在问题:(1)稳定性:即asON易被核酸酶降解(经过化学修饰的类似物也可在体内缓慢清除)。(2)穿透性:即细胞摄取asON的效率有待提高。(3)有效性:asON的非特异性结合降低了其效力。(4)毒性作用:对ｍＲＮＡ非特异性阻断,可能由于asON同ＤＮＡ序列形成部分或暂时性碱基配对;或互补的asON杂交后核糖核酸酶Ｈ加速降解ｍＲＮＡ、形成高浓度的asON单体后降解产物的潜在毒性及其生物学效应的共同结果。2、　毒副作用问题：虽然反义核酸技术原理简单、前景诱人,但在实际使用中同时也存在一些不容忽视的问题:（1）很多寡聚核苷酸缺乏特异性。某些小分子物质和蛋白质能与asON发生序列特异性和非特异性结合;某些asON能在动物体内引起非互补部位的断裂;（2）免疫刺激性和激活补体的能力给猴子一次性注射大剂量asON时发现能通过激活补体引起致死性炎性反应。第2代反义药物有望在一定程度上降低这种副作用;(3)在利用逆转录病毒、腺病毒等作载体时,潜在的危险更值得担忧。因为病毒基因的整合是随机的,这就有可能破坏细胞本身的正常基因、包括一些抑癌基因,甚至有可能激活原癌基因,导致肿瘤发生。另一方面,逆病毒载体很有可能在体内发生重组,产生有活力的逆病毒,使宿主感染病毒。除上述一些方面外,如何建立灵敏的检测手段以监测机体引入外源核酸后的生理变化,如何适应大规模生产,如何降低成本等等一系列问题都有待解决。反义核酸技术与其他治疗方法相比,显示出更多的优势:(1)安全性高,不存在外源性ＤＮＡ整合到靶细胞ＤＮＡ的问题；(2)易合成,设计方便；(3)具有剂量调节效应；(4)能直接作用到基因表达的不同水平,达到抑制基因表达或治疗的目的。3、　反义核酸技术的展望