AE缓冲液word版

TAE缓冲液：电泳缓冲液Tris-乙酸TAE缓冲液成分及终浓度：　　1、2mol/LTris碱　　2、1mol/L乙酸　　3、100mmol/LEDTA　　4、水配制1L的50×TAE缓冲液各成分用量：　　1、Tris碱（242g）　　2、冰乙酸（57.1ml）　　3、EDTA【200ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）】　　4、水（补足1L）50×TAE缓冲液的配制方法：　　称下列试剂，1L烧杯　　Tris                             242g　　Na2EDTA.2H2O   37.2g　　然后加入800ml的去离子水，充分搅拌溶解。　　加入57.1ml的醋酸，充分混匀。　　加去离子水定容至1L，室温保存。AE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 loadingbuffer　loadingbuffer的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。　　loadingbuffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。　　6×loadingbuffer一般配置：　　6×Loadingbuffer:　　30mMEDTA　　36%(v/v)Glycerol（甘油）　　0.05%(w/v)XyleneCyanolFF（二甲苯青FF)　　0.05%(w/v)BromophenolBLUE(溴酚蓝)　　5×SDS-PAGELoadingBuffer配制方法　　组份浓度：　　250mMTris-HCl（pH6.8）　　10％（W/V）SDS　　0.5％（W/V）BPB　　50％（V/V）甘油　　5％（W/V）β-巯基乙醇　　配制量：5mL　　配制方法：　　1.量取下列试剂，置于10mL塑料离心管中。　　1MTris-HCl1.25mL　　SDS　0.5g　　BPB　25mg　　甘油2.5mL　　2.加入去离子水溶解后定容至5mL。　　3.小份（500μl/份）分装后，于室温保存。　　4.使用前将25μl的2-ME加到每小份中。5.加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右1.生物学的聚合酶链式反应定义　　聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：PolymeraseChainReaction），  (​http:​/​​/​baike.baidu.com​/​image​/​9dc3cf58f0bc34ba800a181b"\o"查看图片"\t"_blank​)HYPERLINK"http://baike.baidu.com/image/9dc3cf58f0bc34ba800a181b"\t"_blank"INCLUDEPICTURE"http://imgsrc.baidu.com/baike/abpic/item/9dc3cf58f0bc34ba800a181b.jpg"\*MERGEFORMAT聚合酶链式反应具体内容点击： 聚合酶链式反应(​http:​/​​/​baike.baidu.com​/​view​/​29641.htm"\t"_blank​)，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文PolymeaseChainReaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。由美国科学家PE（PerkinElmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。技术原理　　DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在  (​http:​/​​/​baike.baidu.com​/​image​/​f29faa8faa51ccd5f01f36e5"\o"查看图片"\t"_blank​)HYPERLINK"http://baike.baidu.com/image/f29faa8faa51ccd5f01f36e5"\t"_blank"INCLUDEPICTURE"http://imgsrc.baidu.com/baike/abpic/item/f29faa8faa51ccd5f01f36e5.jpg"\*MERGEFORMAT聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚 合同 劳动合同范本免费下载装修合同范本免费下载租赁合同免费下载房屋买卖合同下载劳务合同范本下载 酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。工作原理　　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时  (​http:​/​​/​baike.baidu.com​/​image​/​a1ad16fa953b7eac59ee90e7"\o"查看图片"\t"_blank​)HYPERLINK"http://baike.baidu.com/image/a1ad16fa953b7eac59ee90e7"\t"_blank"INCLUDEPICTURE"http://imgsrc.baidu.com/baike/abpic/item/a1ad16fa953b7eac59ee90e7.jpg"\*MERGEFORMAT聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。反应体系与反应条件　　标准的PCR反应体系：　　10×扩增缓冲液10ul　　4种dNTP混合物各200umol/L　　引物各10～100pmol　　模板DNA0.1～2ug　　TaqDNA聚合酶2.5u　　Mg2+1.5mmol/L　　加双或三蒸水至100ul　　PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)工作步骤　　标准的PCR过程分为三步：　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA　　2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示：　　现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。反应特点　　特异性强　　PCR反应的特异性决定因素为：　　①引物与模板DNA特异正确的结合；　　②碱基配对原则；　　③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；　　④靶基因的特异性与保守性。　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。　　灵敏度高　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。　　简便、快速　　PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。　　对标本的纯度要求低　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。循环参数　　1、预变性（Initialdenaturation）．　　模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。　　2、引物退火（Primerannealing）　　退火温度一般需要凭实验（经验）决定。　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。　　3、引物延伸　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。　　延伸时间随扩增片段长短而定。　　4、循环中的变性步骤　　循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：　　变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。　　5、循环数　　大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。　　6、最后延伸　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。　　PCR-PCR常见问题电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。　　假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因　　变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。　　出现非特异性扩增带　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。　　出现片状拖带或涂抹带　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。克隆PCR产物　　1)克隆PCR产物的最优条件是什么？　　最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。　　2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？　　如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。　　3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？　　A）涂布未转化的感受态细胞。　　如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。　　B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。　　例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。　　铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ngDNA，用SOC稀释到1000u后含10ngDNA，用1/10铺板，共用1ngDNA。转化率为：　　1000克隆X10（3次方）ng/铺板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug　　转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ug感受态细胞　　如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。　　C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4DNA连接酶替换。　　D）用pGEM-T或pGEM-TEasy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑,没有菌落或少有菌落，连接有问题。　　4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？　　A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。　　B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy载体3`-T缺失。　　C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。　　D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-TEasy载体克隆所需。加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-TpGEM-TEasy载体技术资料（TM042）。　　E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。反应五要素　　参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+　　引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。　　设计引物应遵循以下原则：　　①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。　　②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度　　目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。　　温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。　　③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：　　70～80℃150核苷酸/S/酶分子　　70℃60核苷酸/S/酶分子　　55℃24核苷酸/S/酶分子　　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。编辑本段(​http:​/​​/​baike.baidu.com​/​view​/​2764.htm"\l"#​)2.电子信息学的光电导继电器定义　　光电导继电器简称PCR（英文全称：photoconductiverelay），采用固体半导体元件组装而成——无触点开关（接通和断开无机械接触部件）　　优点：开关速度快工作频率高使用寿命长噪声低工作可靠　　使用场合：取代常规电磁式继电器，广泛用于：数字程控装置，数据处理系统，计算机终端接口电路　　尤其：动作频繁防爆耐潮耐腐蚀的场合　　缺点：漏电流大接触电压高触点单一使用温度范围窄过载能力差价格高基本特点　　①控制功率小：输入很小的控制电流便能正常工作，输出采用大功率管可控硅器件，具有功率放大作用　　②可靠性：绝缘防水材料浇铸，没有可动部件　　③抗干扰能力强：无触点动作，无火花等电磁干扰，输入/输出之间隔离　　④动作快：直流SSR——响应时间＜几十μS过零交流SSR——转换时间≤10Ms（1/2fsf=50Hz）　　⑤寿命长：1012～1013次（普通电磁式继电器105～106次）　　⑥承受的浪涌电流大：6～10倍额定值　　⑦对电源电压适应范围广：交流SSR——30～220VAC任意选择　　⑧耐压水平高：输入/输出介质耐压2.5kV以上分类　　按切换负载性质分：直流固态继电器交流固态继电器　　按输入/输出之间的隔离分：光电隔离磁隔离　　按控制触发信号方式分：过零型非过零型有源触发型无源触发型工作原理　　（以光电耦合式SSR为例说明）　　①无输入信号：T3截止，T4导通，VT1关断（控制极被箝位在低电位）　　②有信号输入：T3导通，T4截止。当电源电压大于过零电压（约±25V），A点电压大于T5的Vbe5→T5导通，VT1控制极处于低电压而关断，VT2控制极无触发信号而关断。　　•当电源电压小于过零电压时，A点电压小于T5的Vbe5→T5截止，VT1控制极通过R5、R6分压获触发信号→VT2导通→B、C两点接通→负载回路接通。　　•VT2导通过程：电源电压“+”：电源→R8→D6→VT1→D9→R9→负载→VT2控制极获得触发脉冲　　电源电压“-”：电源→负载→R9→D8→VT1→D7→R8→电源VT2控制极获得触发脉冲　　•当输入信号取消后：T4导通→VT1关断→但VT2仍导通（负载电流大于维持电流），直至负载电流随电源电压减小，下降到双向晶闸管维持电流以下，VT2关断，从而切断负载电流。编辑本段(​http:​/​​/​baike.baidu.com​/​view​/​2764.htm"\l"#​)3.计算机学的程序控制暂存器定义　　程序控制暂存器简称PCR（英文全称：programcontrolregister），它经历了可编程序矩阵控制器C、可编程序顺序控制器PSC、可编程序逻辑控制器PLC（英文全称：ProgrammableLogicController）和可编程序控制器PC几个不同时期。为与个人计算机（PC）相区别，现在仍然沿用可编程逻辑控制器这个老名字。历史　　1987年国际电工委员会（InternationalElectricalCommittee）颁布的PLC标准草案中对PLC做了如下定义：“PLC是一种专门为在工业环境下应用而设计的数字运算操作的电子装置。它采用可以编制程序的存储器，用来在其内部存储执行逻辑运算、顺序运算、计时、计数和算术运算等操作的指令，并能通过数字式或模拟式的输入和输出，控制各种类型的机械或生产过程。PLC及其有关的外围设备都应该按易于与工业控制系统形成一个整体，易于扩展其功能的原则而设计。”特点　　可靠性高，抗干扰能力强　　PLC用软件代替大量的中间继电器和时间继电器，仅剩下与输入和输出有关的少量硬件，接线可减少到继电器控制系统的1/10~1/100，因触点接触不良造成的故障大为减少。　　高可靠性是电气控制设备的关键性能。PLC由于采用现代大规模集成电路技术，采用严格的生产工艺制造，内部电路采取了先进的抗干扰技术，具有很高的可靠性。例如三菱公司生产的F系列PLC平均无故障时间高达30万小时。一些使用冗余CPU的PLC的平均无故障工作时间则更长。从PLC的机外电路来说，使用PLC构成控制系统，和同等规模的继电接触器系统相比，电气接线及开关接点已减少到数百甚至数千分之一，故障也就大大降低。此外，PLC带有硬件故障自我检测功能，出现故障时可及时发出警报信息。在应用软件中，应用者还可以编入外围器件的故障自诊断程序，使系统中除PLC以外的电路及设备也获得故障自诊断保护。这样，整个系统具有极高的可靠性也就不奇怪了。硬件　　配套齐全，功能完善，适用性强PLC发展到今天，已经形成了大、中、小各种规模的系列化产品，并且已经标准化、系列化、模块化，配备有品种齐全的各种硬件装置供用户选用，用户能灵活方便地进行系统配置，组成不同功能、不同规模的系统。PLC的安装接线也很方便，一般用接线端子连接外部接线。PLC有较强的带负载能力，可直接驱动一般的电磁阀和交流接触器，可以用于各种规模的工业控制场合。除了逻辑处理功能以外，现代PLC大多具有完善的数据运算能力，可用于各种数字控制领域。近年来PLC的功能单元大量涌现，使PLC渗透到了位置控制、温度控制、CNC等各种工业控制中。加上PLC通信能力的增强及人机界面技术的发展，使用PLC组成各种控制系统变得非常容易。易学易用，深受工程技术人员欢迎控制技术　　PLC作为通用工业控制计算机，是面向工矿企业的工控设备。它接口容易，编程语言易于为工程技术人员接受。梯形图语言的图形符号与表达方式和继电器电路图相当接近，只用PLC的少量开关量逻辑控制指令就可以方便地实现继电器电路的功能。为不熟悉电子电路、不懂计算机原理和汇编语言的人使用计算机从事工业控制打开了方便之门。系统的设计、安装、调试工作量小，维护方便，容易改造PLC的梯形图程序一般采用顺序控制设计法。这种编程方法很有规律，很容易掌握。对于复杂的控制系统，梯形图的设计时间比设计继电器系统电路图的时间要少得多。PLC用存储逻辑代替接线逻辑，大大减少了控制设备外部的接线，使控制系统设计及建造的周期大为缩短，同时维护也变得容易起来。更重要的是使同一设备经过改变程序改变生产过程成为可能。这很适合多品种、小批量的生产场合。体积小，重量轻，能耗低以超小型PLC为例，新近出产的品种底部尺寸小于100mm，仅相当于几个继电器的大小，因此可将开关柜的体积缩小到原来的1/2~1/10。它的重量小于150g，功耗仅数瓦。由于体积小很容易装入机械内部，是实现机电一体化的理想控制设备。趋势与动向　　一、当代PLC技术的发展趋势　　发展迅速，产品更新换代；开发各种智能化模块，不断增强过程功能；PLC与个人计算机（PC）结合；通信联网功能不断增强；发展新的编程语言，增强容错功能。　　二、当代PLC技术的发展动向美国通用汽车以用户身份提出新一代控制器应具备十大条件，这十大条件是：　　1.编程方便，可在现场修改程序；　　2.维修方便，最好是插件式；　　3.可靠性高于继电器控制柜；　　4.体积小于继电器控制柜；　　5.可将数据直接送入管理计算机；　　6.在成本上可与继电器控制竞争；　　7.输入可以是交流115V；　　8.输出为交流115V/2A以上，能直接驱动电磁阀；　　9.在扩展时，原有系统只要很小变更；　　10.用户程序存储容量至少能扩展到4K字节。研制　　1969年美国数字设备公司成功研制世界第一台可编程序控制器PDP-14，并在GM公司的汽车自动装配线上首次使用并获得成功。接着美国MODICON公司也研制出084控制，从此，这项新技术迅速在世界各国得到推广应用。1971年日本从美国引进这项技术，很快研制出第一台可编程序控制器DSC-18。1973年西欧国家也研制出他们的第一台程序控制暂存器。我国从1974年开始研制，1977年开始工业推广应用。进入20世纪70年代，随着微电子技术的发展，尤其是PLC采用通讯微处理器之后，这种控制器就不在不局限于当初的逻辑运算了，功能得到更进一步增强。进入20世纪80年代，随着大规模和超大规模集成电路等微电子技术的迅猛发展，以16位和少数32位微处理器构成的微机化PLC，使PLC的功能增强，工作速度快，体积减小，可靠性提高，成本下降，编程和故障检测更为灵活，方便。编辑本段(​http:​/​​/​baike.baidu.com​/​view​/​2764.htm"\l"#​)4.电子学的节目时钟参考　　节目时钟参考简称PCR（英文全称：programclockreference），是一个实时传输系统,为了保证收发端的正常工作,接收端与发射端的频率和相位一致,必须建立收发端的同步时钟,即PCR(ProgramClockReference)码,.所谓PCR就是指节目时钟参考,在发端,利用计数器对系统进行计数,形成PCR值,然后每隔一段时间将PCR值随数据一起传送给收端;收端有一个正在工作的本地时钟,其额定频率与发端时钟相等,同样也有一个计数器对它计数形成一个本地时钟参考.这时发端会将PCR从传送流中提出来,与音频帧、视频帧的编码信息插入PES包中,接收端将音频帧、视频帧中的PCR值放在缓存器中,等待比较发端的音视频中的值出现,然后用比较的结果控制压控振荡器(VCXO),通过调整使收发端的频率锁相,从而实现收发端声音和图像完全同步。（注：本资料素材和资料部分来自网络，仅供参考。请预览后才下载，期待您的好评与关注！）PAGE/NUMPAGES