大肠杆菌外膜蛋白的分离及其双向电泳图谱的建立

现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.2 ·基础研究· 大肠杆菌外膜蛋白的分离及其双向电泳图谱的建立 * 夏金兰△ 欧阳叙东 张成桂 彭安安 王 晶 （中南大学资源加工与生物工程学院生物冶金教育部重点实验室 湖南长沙 410083） 摘要：本文利用温度诱导的两相分离萃取技术选择性分离未经机械破碎的大肠杆菌细胞外膜蛋白，研究 Triton X-114的浓度及处 理时间对提取外膜蛋白的影响。实验结果表明，Triton X-114的使用浓度和作用时间均显著影响外膜蛋白的提取效率。SDS - PAGE结果表明不同 Triton X-114的使用浓度和作用时间只是影响了外膜蛋白的提取效率而对外膜蛋白提取的种类没有影响。 实验发现 8%的 Triton X-114处理 3小时为最佳分离条件，分离得到的样品可用于双向电泳分析。通过对比实验发现样品裂解液 中包含低浓度的 Tris是外膜蛋白双向电泳成功的关键因素，CHAPS与 ASB-14或 NP-40结合使用可显著提高外膜蛋白的溶解能 力，缩短聚焦时间，从而优化了大肠杆菌外膜蛋白双向电泳技术体系，建立了其双向电泳图谱。 关键词：大肠杆菌；外膜蛋白；Triton X-114；双向电泳 中图分类号：Q591.2 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009）02-201-04 Rapid and Efficient Extraction of Outer Membrane Proteins from Escherichia coli and Establishment of the Two - Dimensional Electrophoresis Maps* XIA Jin-lan△, OU-YANG Xu-dong, ZHANG Cheng-gui, PENG An-an, WANG Jing （Key laboratory of Biohydrometallurgy of MOE, School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha, 410083, Hunan, China） ABSTRACT: The outer membrane proteins (OMPs) are important part in the Gram-negative bacteria,which are responsible for mass transport,signal recognition and cell attachment. Extraction of outer membrane proteins is the initial step for their further investigation. The traditional extraction methods, however, are time-consuming,complex and difficult to differentiate the outer membrane proteins from the cytoplasm membrane proteins. In this paper, we reported a rapid and efficient method based on temperature-induced phase separation technique to extract selectively the outer membrane proteins from the unbroken Escherichia coli cells.By systematic experimental essaying on the effects of Triton X-114 concentrations and the treatment time on the extraction ofOMPs,we found that 8 % of Triton X-114 treating for 3 hours was the optimal extraction condition. The extracted samples were separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE).The 2-DE results indicated that lysis buffer containing low concentration Tris played a key role for the success of 2-D,and that CHAPS combined with ASB-14 orNP-40 could increase the outer membrane proteins solubilization and decrease the isoelectric focusing time.Thus, an efficient 2-D separation system for Escherichia coli outer membrane proteins was established. Key words: Escherichia coli; Outermembrane proteins;Triton X-114; Two-dimensional electrophoresis Chinese Library Classification: Q591.2 Document code: A Article ID: 1673-6273（2009）02-201-04 *基金项目：国家 973计划 "微生物冶金的基础研究 "项目（2004CB619201）,国家自然基金创新研究群体科学基金项目（50621063）， 国家自然科学基金项目（50674101） 作者简介：欧阳叙东，（1981-），男，硕士研究生，研究方向：微生物分子生物学，Email: ouyang123net@163.com △通讯作者：夏金兰，教授，博士生导师，E-mail: jlxia@mail.csu.edu.cn （收稿日期：2008-06-30 接受日期：2008-07-27） 前言 外膜是革兰氏阴性细菌与外界环境的接触面，其主要成分 为脂质、脂多糖和外膜蛋白。外膜蛋白是外膜的主要组成成分， 在物质转运、信息识别、细胞吸附等方面具有重要作用[1]。然 而由于外膜蛋白的疏水特性，其分离和分析较为困难，从而成 为当今微生物界的一个研究重点与难点。 常用的外膜蛋白提取方法主要有等密度梯度离心法 [2]， Sarkosyl法[3]和碳酸钠法[4]，这些方法耗时长，仪器设备要求高， 提取步骤繁多，同时很难严格地将同属膜结构的质膜与外膜区 分开来。Triton X-114为一种非离子温和型去垢剂，具有低“雾 点”（22℃）的特性，该去污剂在 0℃时能与水溶液很好的混合 形成一个均质的液相，当温度超过 20℃时该去污剂的水溶液 分成两个相：一个是富含胶束的表面活性剂相；一个是几乎不 含胶束的水相。疏水性物质由于溶于表面活性剂形成的胶束之 中，分相后进入去污剂相。而亲水性物质则留于水相。Triton X-114在 4℃条件下可选择性地溶解未经破碎的细胞外膜，当 温度升高超过“雾点”时，发生相分离，疏水性蛋白质选择性地 分配到去垢剂富集相内[5]，从而简化了外膜蛋白的分离步骤，降 低了外膜蛋白分离的设备要求。 蛋白质组学技术近年来在水溶性蛋白质的分析中取得了 长足的发展，但是在应用其进行膜蛋白研究时遇到了很大的挑 201· · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.2 战。双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）技术目前 仍然是研究蛋白质组学的主要技术之一，具有简便、快速、形 象、高分辨率和重复性好等优点，利用该技术可对一种样本中 的多种蛋白质同时进行系统化的分离、鉴定、定量。利用双向电 泳研究膜蛋白面临的主要问题就是膜蛋白的高疏水性，其在等 电聚焦条件下得不到较好溶解，同时在等电聚焦时蛋白质在等 电点容易聚合沉淀。因此建立一个针对外膜蛋白的2-DE的电 泳体系对于分离分析外膜蛋白至关重要。 嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，简写 为 A.f）为革兰氏阴性、化能自养菌，该菌是重要的生物浸出功 能菌。研究表明，A.f菌的胞外成分和外膜蛋白在硫的生物氧化 过程中起到重要作用。由于 A.f为化能自养菌，生长缓慢、菌体 收集困难，而采用 Triton X-114分离外膜蛋白需要大量菌体， 采用 A.f建立外膜蛋白的分离及双向电泳体系，菌体培养及收 集工作强度太大，因此本文以细胞包被结构与 A.f相似的 E. coli为模式菌建立了外膜蛋白的分离体系与双向电泳图谱。为 A.f菌外膜蛋白的选择性分离和双向电泳图谱谱的建立奠定基 础。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1 材料、试剂和设备 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，购自 BBI公司。苯甲基磺酰氟 （PMSF）、碘乙酰胺、DTT、N'N'N'N'-四甲基乙二胺（TEMED）购 自 Sigma公司；Tris-碱、溴酚蓝、尿素、硫脲、过硫酸铵、碳酸钠、 乙酸钠、硫代硫酸钠、EDTA 二钠盐、甘氨酸、考马斯亮蓝 G-250、2-巯基乙醇购自上海生工。十二烷基磺酸钠（SDS）、低 分子质量标准蛋白质均购自 BBI。固相 pH梯度干胶条（IPG干 胶条，pH 3-10，24 cm）、IPG buffer（pH 3-10）、Ettan IP Gphor 3 等电聚焦和电泳系统购自 GE公司。 1.2 方法 1.2.1 大肠杆菌的培养与收集 将大肠杆菌 BL-21 接种于 LB 培养基培养至对数期后，10000 r/min离心 6 min，菌体悬浮于 pH 7.3的磷酸盐缓冲液（PBS）中，洗涤菌体 3次。 1.2.2 Triton X-114最佳浓度的确定 将洗涤后的菌体悬浮于 1 %、2 %、4 %、6 %、8 %、9 %、10 %、12 % Triton X-114 的 2 mmol/L PBS（内含 1 mmol/L苯甲基磺酰氟）中，在 4℃下冰浴 1 h、10000 r/min离心 15 min，收集上清，为避免上清中有少量 菌体污染，重复离心 3次。上清于 37℃下温浴 15 min诱导溶 液分相，然后 37℃下 3000 r/min离心 10 min促进相分离，收集 上层水相留作 SDS-PAGE分析，下层去污剂相以 PBS添加到 原体积重复上述相分离操作 3次。最后在分离到的去污剂相中 加入 9 倍体积的无水乙醇，-20 ℃下过夜沉淀蛋白。4 ℃下 10000 r/min离心 30 min收集蛋白，将蛋白悬浮于灭菌去离子 水中透析处理 96 h。透析后的蛋白经冷冻干燥后溶解于样品裂 解液。Bradford法测定蛋白质浓度。 1.2.3 最佳处理时间的确定 将收集得到的菌体悬浮于含有 8 %的 Triton X-114中。悬浮后的菌体在 4℃下分别冰浴 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。离心收集上清，重复上述相分离操作。 1.2.4 SDS-PAGE分析 5 %的分离胶与 12 %的浓缩胶对大肠 杆菌的全蛋白与分离得到的外膜蛋白进行 SDS-PAGE分析。 30 μg蛋白质混合 5 μL上样缓冲液，沸水中煮沸 5 min后上 样。电泳缓冲液为 Laemmli。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝 R-250胶体染色。 1.2.5 双向电泳分析 采用以下 4种裂解液分别对样品进行处 理，双向电泳分析比较确定外膜蛋白最佳样品裂解液。样品裂 解液 1：8 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4 % CHAPS、65 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF、0.5 % IPG buffer。样品裂解液 2：8 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4 % CHAPS、65 mmol /L DTT、0.5 mmol/L PMSF、0.5 % IPG buffer、40 mmol/L Tris。样品裂解液 3：8 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4 % CHAPS、1 % NP-40、65 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF、0.5 % IPG buffer、40 mmol/L Tris。样品裂解液 4：8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4 % CHAPS、1 % ASB-14、65 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF、0.5 % IPG buffer、40 mmol Tris。 水化液统一为：8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2 % CHAPS、 18 mmol/L DTT、0.5 mmol /L PMSF、0.5 % IPG buffer、0.002 % 溴酚蓝。 水化液体积为 650 μL，蛋白质上样量为 500 μg。将等电聚 焦后的 IPG 胶条于 10 mL 平衡缓冲液 I [平衡缓冲母液（6 mol/L尿素，2 % SDS，50 mmol/L、pH 8.8 Tris-HCl，30 %甘油， 0.002 %溴酚蓝）+ 1 % DTT]内振荡平衡 15 min；换用平衡缓 冲液 II（平衡缓冲液母液中 +2.5 %碘乙酰胺）振荡 15 min。平 衡好的胶条移至聚丙烯酰胺凝胶上端上部用 0.5 %低熔点琼 脂糖封胶后进行二向垂直平板 SDS-PAGE。 2 结果 2.1 浓度对提取效率的影响 使用 1 %、2 %、4 %、6 %、8 %、9 %、10 %、12 %的 Triton X-114提取细菌外膜蛋白，结果表明 8 %的 Triton X-114提取 效果最好，以后提高 Triton X-114的浓度并不能显著提高外膜 蛋白的提取率，见图 1。但 SDS-PAGE分析发现不同浓度 Tri- ton X-114只是影响了外膜蛋白的提取率，并没有影响提取的 外膜蛋白的种类（如图 3）。 2.2 时间对提取效率的影响 将收集得到的菌体悬浮于含有 8 %的 Triton X-114中，4 ℃下分别冰浴 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，结果发现冰浴 3 h，外膜蛋 白的提取率达到最佳，以后延长作用时间不会显著提高外膜蛋 白的提取率，见图 2。SDS-PAGE分析发现 Triton X-114作用时 间只是影响外膜蛋白的提取率，而对提取到的外膜蛋白种类没 有影响（图 4）。 2.3 双向电泳结果 2.3.1 不同聚焦时间对双向电泳结果的影响 双向电泳运行参 数的选择直接影响 2-DE图谱的质量，选择不适合的电泳参数 会导致 2-DE图谱上出现横向或纵向条纹、蛋白点的拖尾及不 规则的蛋白质点，使几个蛋白点连在一起或成线状，导致蛋白 点的等电点难以确定。因此双向电泳技术参数至关重要，影响 到 2-DE图谱的分辨率和重复性。选择高伏时、长时间的参数进 行蛋白质等电聚焦，可以使样品在开始聚焦前的阶段维持低电 压的时间比较长（大约 2 h，小于 500 V）。低电压既有利于除盐 和其它杂质，样品又能够充分地进入凝胶，聚焦效果好，提高了 202· · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.2 图 1 不同浓度 Triton X-114对外膜蛋白提取效率的影响 Fig. 1 The influence of different Triton X-114 concentration on the outer membrane proteins extraction efficiency 图 2 不同处理时间对外膜蛋白提取效率的影响 Fig. 2 The influence of different treated time on the outer membrane proteins extraction efficiency 分辨率。如果聚焦时间短，容易在靠近阳极端的胶条上产生蛋 白沉淀，在第二向电泳后的凝胶上形成纵条纹；如果等电聚焦 不完全，在凝胶上容易产生水平条纹。但是过度等电聚焦（＞ 105 kVh）能够造成电渗和蛋白质飘移，影响电泳结果。实验中 发现 8000 V等电聚焦 10 h时（如图 5 B），相对于 8000 V等电 聚焦 6 h（图 5 A）在凝胶上显现的蛋白质斑点多，且清晰。实验 发现，选择适宜的总伏时、长时间的 IEF等参数可以有效地减 少 2-DE凝胶中常见的横、纵纹现象。 2.3.2 不同样品裂解液对双向电泳结果的影响 裂解液中的各 种成分，促使样品蛋白质充分解聚，并完全溶解，确保可以获得 清晰的图像。尿素能改变或破坏氢健等次级键的结构，使蛋白 质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使用可以破坏疏水 健，防止聚集作用和二级结构形成，大大增加了蛋白质的溶解 性，特别是膜蛋白。DTT是还原剂，在 50 mmol/L时可以有效的 还原大部分二硫健。去污剂可以破坏蛋白质分子之间的疏水作 用，提高蛋白质溶解性，防止蛋白质在等电聚焦时析出。两性电 解质能促进蛋白质溶解，提高极性端蛋白质的聚焦效果。在实 验过程中低温和蛋白酶抑制剂有助于避免组织蛋白质降解。 图 3 不同浓度 Triton X-114提取外膜蛋白 SDS-PAGE分析 Fig. 3 The SDS-PAGE analysis of the outer membrane proteins extracted with different Triton X-114 concentration Note: Lane 1: total proteins; lane 2: 1%; lane 3: 2%; lane 4: 4% ; lane 5: 6%; lane 6: 8%; lane 7: 10%; lane 8: marker. 图 4 不同处理时间提取外膜蛋白 SDS-PAGE分析 Fig.4 The SDS-PAGE analysis of the outer membrane proteins extracted when treated for different time Note: Lane 1: total proteins; lane 2: 1h; lane 3: 2h; lane 4: 3h; lane 5: 4h; lane 6: 5h; lane 7: marker. 图 5 裂解液 2溶解外膜蛋白不同等电聚焦时间双向电泳图谱的比较 Fig. 5 2-DE maps of different isoelectric focusing time Note: A: The 2-DE maps of 8000 V isoelectric focusing for 6h;B: The 2-DE maps of 8000 V isoelectric focusing for 10h 实验结果表明 Tris碱对膜蛋白的聚焦具有重要作用，没有 Tris碱的样品裂解液中，蛋白质无法聚焦（如图 6 A），提高尿素 浓度与延长聚焦时间均无法解决该问题，当样品裂解液中加入 一定量的 Tris碱（终浓度 5 mmol/L）后，8000 V聚焦 10 h后取 得较佳聚焦效果（如图 6 B）。NP-40为一种非离子型去污剂，其 结合 CHAPS使用溶解外膜蛋白的效果优于单纯使用 CHAPS， 8000V聚焦 6 h后凝胶上出现了更多的蛋白斑点（如图 6 C）， 而 ASB-14结合 CHAPS则效果更佳（如图 6 D）。实验结果表明 CHAPS结合 ASB-14或 NP-40使用可促进蛋白质溶解，缩短 聚焦时间，提高聚焦效果。 203· · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.2 3 讨论 革兰氏阴性细菌外膜蛋白的分离提取，一直以来都是限制 对其进行进一步研究的瓶颈。传统的提取方法，费时，耗钱，仪 器设备要求高，建立一种有效的，简便的外膜蛋白分离方法，是 对革兰氏阴性细菌外膜蛋白进行相关研究的重要前提。本文利 用 Triton X-114直接作用于未经机械破碎的大肠杆菌细胞提 取外膜蛋白，系统的研究了 Triton X-114的浓度和作用时间对 提取效率的影响，结果发现 8 %的 Triton X-114作用 3 h提取 效率最高。 浓度对外膜蛋白提取效率的影响可能有以下两种原因： （1）在一定浓度范围内，提高 Triton X-114的浓度可增加膜蛋 白与去污剂分子相互接触作用的概率，从而有利于把膜蛋白从 双层磷脂结构中溶解出来。（2）当细菌的用量较大时，在体积一 定的低浓度的提取体系其 Triton X-114的量不足以和所有的 膜蛋白发生反应，从而使一部分可通过 Triton X-114溶解的膜 蛋白得不到有效溶解，从而影响膜蛋白的提取效率。但是，从 SDS-PAGE结果来看，不同浓度的 Triton X-114只影响膜蛋白 的提取量，而没有影响膜蛋白的提取种类。 膜蛋白都是一些高疏水性蛋白，双向电泳分析膜蛋白的一 大重要挑战就是如何提高膜蛋白的溶解性。高浓度的尿素和硫 脲的联合使用，通过破坏氢键促使蛋白去折叠，暴露其疏水部 分，从而显著提高膜蛋白的溶解性[6]。为了防止蛋白在电泳过程 中的聚合与沉淀，通常在样品裂解液中加入一定量的去污剂。 2 % - 4 %的兼性去污剂 3-[（3-胆胺丙基）二甲基铵]-1-丙基磺 酸盐（CHAPS）是双向电泳中应用较多的去污剂，但其溶解蛋白 质的能力较弱，特别是当有较高浓度的硫脲存在时，其溶解蛋 白的效果更差。Santoni等[7]比较两性离子去污剂（如 CHAPS、3- [N, N-二甲基（3-十四酰胺）丙基铵]-丙磺酸（ASB-14）、3-[N, N-二甲基（3-十六酰胺）丙基铵]-丙磺酸（ASB-16）、三丁基磷 （TBP））溶解膜蛋白的能力，发现 ASB-14具有较好的溶解效 果。Luche等[8]研究发现兼性离子去污剂比非离子型去污剂具 有更强的溶解膜蛋白的能力。Chevallet等[9]新合成了一种新的 兼性去污剂 ASB-14，该去污剂对膜蛋白的溶解效果要优于 CHAPS。 膜蛋白种类繁多，单独使用某一种去污剂溶解效果不佳， 不同类型去污剂的结合使用对膜蛋白的溶解更有利。Zhang等[10] 在研究肝细胞的质膜蛋白时发现兼性去污剂与非离子型去污 剂结合使用可促进膜蛋白的溶解。从实验结果来看，NP-40结 合 CHAPS使用效果优于单纯使用 CHAPS，凝胶上出现了更多 的蛋白斑点，而 ASB-14结合 CHAPS则效果更佳。另外 Tris碱 对膜蛋白的聚焦也具有重要作用，在没有 Tris碱的 IEF样品裂 解液中，蛋白质无法聚焦，提高尿素使用浓度与延长聚焦时间 均无法解决该问题。但是当样品溶解液中加入一定量的 Tris碱 （终浓度 6.6 mmol/L）后，8000 V聚焦 10 h后聚焦效果较佳。说 明低浓度的 Tris碱对膜蛋白的正常聚焦具有重要作用。 Tris碱可能的作用主要有两点：（1）调节样品溶解液的 pH 值。由于大肠杆菌的外膜蛋白等电点大多位于 pH 4-7之间[11]， 当其溶于缓冲能力较差的样品溶解液中时，样品溶解液的 pH 值急剧降低（约为 pH 4.5），这时带有相同电荷的样品在外加电 场的作用下，瞬间移向蛋白质的酸性段，造成蛋白样品的反复 聚合与溶解，从而使 2 - DE凝胶上产生横向条纹，Tris碱的加 入调节了样品的 pH值，避免了短时间大量蛋白的聚集，从而 避免了横向条纹的产生。（2）Tris碱的加入使样品溶解液偏碱 性，促进了蛋白质的变性，提高了蛋白质的溶解能力，从而使蛋 白质更易在外加电场的作用下运动。 4 结论 本文利用温度诱导的两相萃取技术选择性分离未经机械 破碎的大肠杆菌细胞外膜蛋白，研究了 Triton X-114的浓度及 处理时间对提取外膜蛋白的影响。实验结果表明，Triton X-114 的使用浓度和作用时间均显著影响外膜蛋白的提取效率。 SDS-PAGE结果表明不同 Triton X-114 的使用浓度和作用时 间只是影响了外膜蛋白的提取效率而对提取到的外膜蛋白种 类没有影响。实验发现 8 %的 Triton X-114处理 3 h为最佳分 离条件。分离得到的样品可用于双向电泳分析，通过对比实验 发现样品裂解液中包含低浓度的 Tris是外膜蛋白双向电泳成 功的关键因素，CHAPS与 ASB-14 或 NP-40 结合使用可显著 提高外膜蛋白的溶解能力，缩短聚焦时间，从而优化了大肠杆 菌外膜蛋白双向电泳技术体系，建立了其双向电泳图谱。这些 结果为研究具有类似细胞结构的生物浸出功能菌的外膜蛋白 的选择性分离和双向电泳谱的建立奠定了基础。 参考文献（References） [1] Osborn MJ. 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J Biol Chem, 1981, 256(4):1604-1607 （下转第 215页） 图 6 不同样品裂解液的双向电泳图谱 Fig. 6 2-DE maps of different lysis buffer Note: A: lysis buffer 1; B: lysis buffer 2; C: lysis buffer 3; D: lysis buffer 4 204· · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.2 （上接第 204页） [6] Rabilloud T, Adessi C, Giraudel A. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients [J]. Electrophoresis, 1997, 18(3-4):307-316 [7] Santoni V, Kieffer S, Desclaux D, et al. Membrane proteomics: use of additive main effects with multiplicative interaction model to classify plasma membrane proteins according to their solubility and elec- trophoretic properties[J]. Electrophoresis, 2000, 21(16): 3329-3344 [8] Luche S, Santoni V, Rabilloud T. Evaluation of nonionic and zwitteri- onic detergents as membrane protein solubilizers in two-dimensional electrophoresis [J]. Proteomics, 2003, 3(3):249-253 [9] Chevallet. M, Santoni V, Poinas A. 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Eur J Biochem, 2000, 267(10): 2871-2881 时期[9]。胚胎 E9.5时是胚胎发育中器官原基形成时期，0610038 D11Rik mRNA在E9.5中枢神经系统最初的三个脑泡以及分化 后的端脑、间脑，后脑均有所表达，并在相应的细胞增殖部位富 集。在 E10.5时，小鼠胚胎各器官组织形成分化原基，细胞快速 增殖，0610038D11Rik在该时期遍及整个背神经嵴表达，提示 0610038D11Rik可能参与了神经管的关闭，并在神经胚形成发 挥功能作用。在 E11.5时也检测到 0610038D11Rik在端脑、间 脑、菱脑，背神经嵴处较强分布。在心脏检测到的 0610038D11Rik表达信号提示 0610038D11Rik对小鼠胚胎中 后期心脏的发育也可能起到一定的作用。Northern Blotting检 测结果也显示 0610038D11Rik在多组织器官表达，尤其在脑， 肺、肾，肝等重要脏器，因此 0610038D11Rik在胚胎发育早期可 能参与神经发生和多种组织器官的生成[5,10,11]。 细胞定位结果显示了该基因在全细胞表达，提示了该基因 功能广泛。生物信息学预测该基因含有 Trm112p的结构域。在 酵母 tRNA中 TRM112含有假定的锌指结构，可能影响 tRNA 的作用底物，对甲基化起某种特殊催化作用，并且酵母中缺失 该基因将导致严重的生长抑制[12]。实验结果显示，其表达产物 易在核内富集，并且在早期发育中细胞快速增殖的部位都有该 基因的表达，暗示其可能作为某种关键的功能蛋白参与细胞核 内外的调控作用。 本实验初步研究了 0610038D11Rik在发育过程的表达和 定位，结果提示在小鼠发育的不同阶段, 0610038D11Rik对神 经管的关闭，脑的发育，以及一些重要器官（脑、肾、肺等）的形 成以及功能的维持，可能发挥一定的功能作用，由于该基因在 小鼠发育阶段直至出生后都呈现持续性表达，并且在多组织器 官广泛表达提示其可能作为重要的细胞因子参与机体调控。 参考文献（References） [1] Neidhardt L, Gasca S, Herrmann BG, et al. 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