以壳聚糖为载体固定化青霉素酰化酶的研究

以壳聚糖为载体固定化青霉素酰化酶的研究 宋建彬 任孝修 （北京化工大学理学院，北京100029） 摘 要 介绍了以壳聚糖为载体固定化青霉素酰化酶需首先制备壳聚糖颗粒，使用戊二醛、甲醛、乙二醛3 种 活化剂处理所得的壳聚糖颗粒，确定了以戊二醛为活化剂交联其上的氨基共价结合青霉素酰化酶的固定化方法。 从戊二醛的浓度、pH 值、固定化时间、固定化pH 值、酶用量等条件摸索了最佳固定化条件，获得了酶活力为 40 000 U／（g·h）、回收率为50 %左右的固定化青霉素酰化酶。 关键词 壳聚糖，青霉素酰化酶，固定化酶 中图分类号 @ 55 文献标识码 A 文章编号 1000 -6613（2004）02 -0181 -04 固定化酶是近代酶工程领域中的主要研究内 容。这种利用生物催化特性，在温和、无环境污染 的条件下解决化工、医药、食品和环境工程的应用 技术，是实现绿色化学的重要途径。固定化青霉素 酰化酶可用于水解青霉素 G 制备半合成青霉素的 关键中间体6 - 氨基青霉烷酸（6 - APA），具有稳 定性好、转化率高、产品纯度高、污染少、成本低 等优点，受到人们的重视［1］。自20 世纪70 年代 初，欧美国家已开始用特殊的合成树脂固定化青霉 素酰化酶来生产6 - APA，但价格昂贵，酶活还较 低［2］。中国关于固定化青霉素酰化酶的研究工作 起步较晚，还要靠进口价格昂贵的固定化载体或固 定化青霉素酰化酶来满足半合成青霉素生产的需 要［3，4］。因此，对青霉素酰化酶固定化载体进行研 究不仅具有理论价值，更具有重要的现实意义。 壳聚糖是一种价格便宜、来源丰富的天然高分 子，对酶无毒；且壳聚糖易于成型，使固定化酶的 外型能满足生化反应器的结构要求。本文作者以壳 聚糖为载体，用戊二醛交联的方法固定化青霉素酰 化酶，对固定化条件的影响做了初步探讨，旨在寻 求一种简便、经济、具有稳定的高酶活的固定化酶 方法。 1 试验部分 !"! 试验原料 戊二醛，生化试剂，天津医药公司；甲醛，分 析纯，石家庄有机化工厂；乙二醛，分析纯，苏州 正兴化工研究所；氢氧化钠、乙酸，分析纯，北京 化工厂；邻苯二甲酸氢钾pH 值 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 物质，国家标 准物质研究中心；青霉素G 钠盐、青霉素酰化酶， 华北制药厂；多聚磷酸钠，化学纯，浙江菱湖食品 化工厂；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，分析纯，北京 新光化学试剂厂。 !"# 试验原理 1. 2. 1 固定化酶的反应原理 醛的羰基和一级胺、二级胺能发生亲核加成反 应生成西佛碱（Schiff base）［5］，因此利用甲醛和双 功能团的醛类化合物如戊二醛等与壳聚糖及蛋白酶 的氨基发生的Schiff 反应，可用来固定化青霉素酰 化酶。其键合机理如下： 壳聚糖的氨基+ OHC（CH2）3CHO+ !酶的氨基 壳聚糖— ""N CH（CH2）3 ""CH N—酶 1. 2. 2 酶活的测定原理 青霉素G 钠盐在青霉素酰化酶的作用下，水 解成6 - 氨基青霉烷酸（6 - APA）和苯乙酸，用 NaOH 溶液中和生成的苯乙酸，使反应体系保持恒 定的pH 值。记下反应12 mi n 内消耗NaOH 溶液的 体积数，从 NaOH 溶液的体积数求得生成苯乙酸 的量。特定条件下，单位时间内单位酶量生成的苯 乙酸的微克分子数为酶活。其中青霉素钠盐的水解 反应如下： !"$ 试验方法 1. 3. 1 壳聚糖载体的制备 称2 g 壳聚糖溶解在100 mL 的5 %的乙酸溶液 收稿日期 2003 -08 -12；修改稿日期 2003 -11 -24。 第一作者简介 宋建彬（1977—），男，硕士。电话 010 - 64445058；E- mail songtj u!eyou. com。 ·181·2004 年第23 卷第2 期 化 工 进 展 CHEMICAL I NDUSTRY AND ENGI NEERI NG PROGRESS 中，在微火上缓慢加热，溶解，吸入针管，用针筒 注入2 %的多聚磷酸钠溶液中，搅拌，使其凝固成 颗粒状，浸泡1 !1. 5 h，抽滤，水洗至 pH 值为 中性。 1. 3. 2 用活化剂活化壳聚糖载体 用不同的醛在不同pH 值下，在室温与上述壳 聚糖载体置于转速为150 r／min 摇床上，反应1. 5 h， 以蒸馏水充分洗涤。 1. 3. 3 用活化载体固定化青霉素酰化酶 在上述预处理的活化壳聚糖载体中加入一定量 的酶液，在不同pH 值下，置于转速为150 r／min 摇床上振摇12 h，充分洗涤后测固定化酶活和残余 酶液的酶活。 1. 3. 4 酶活的测定 采用碱滴定法［6，7］，在50 mL 去离子水中加入 1. 25 mL 的KH2PO4 - K2HPO4 缓冲液以及1 mL 游 离酶或一定量的固定化酶（a）；再取50 mL 的4 % 的青霉素G 溶液（b）；接着将a、b 水溶液恒温至 37 C，混合于一烧杯中，迅速测定其pH 值，用 NaOH 滴定生成的苯乙酸，使pH 值一直控制在初 值，测定12 mi n，记录 NaOH 用量体积数，用以 下公式算出游离酶活： 游离酶活= !NaOH> "NaOH／（!青霉素酰化酶>#）> 1 000 式中 "NaOH———NaOH 的物质的量浓度，mol／L； #———测定时间，h； !NaOH———消耗的NaOH 的体积数，mL； !青霉素酰化酶———青霉素酰化酶的体积数，mL； 游离酶活的单位为U／（h·mL）； 固定化酶活的单位为U／（h·g）。 1. 3. 5 回收率的测定 按上述方法分别测定固定化酶活及游离酶的酶 活，按下式计算回收率： 结合酶活= 酶液初始总酶活- 残余酶液的酶活 酶活回收率= 固定化酶的酶活 结合酶活 2 结果与讨论 !"# 活化剂活化条件的确定 2. 1. 1 活化剂种类的确定［8］ 采用戊二醛、甲醛、乙二醛分别处理上述制得 的壳聚糖载体，用其固定化酶与不加活化剂直接吸 附法固定化酶的酶活相比较，结果见表1。 由表1 可以看出，以戊二醛固定化酶活的效果 最佳，甲醛和乙二醛的固定化酶活和回收率均较 表# 活化剂种类对固定化酶活及回收率的影响 活化剂种类 固定化酶活／U·h -1·g -1 回收率／% 戊二醛 16 460. 91 30. 67 乙二醛 7 831. 46 17. 24 甲醛 9 352. 94 22. 65 直接吸附 7 563. 69 20. 29 注：酶液用量为10 mL，游离酶活为5 804 U／（h·mL），戊二 醛、乙二醛、甲醛溶液pH 值分别为最佳值8. 0、8. 0、8. 5。 低，说明甲醛、乙二醛不适合活化壳聚糖固定化青 霉素酰化酶。这可能是用甲醛、乙二醛活化的载体 比戊二醛更易使酶蛋白失活的缘故［9］。直接吸附 所得到的固定化酶的酶活也不高，可见直接吸附法 固定化的效果不佳。故采用戊二醛为活化剂固定化 青霉素酰化酶。 2. 1. 2 活化剂戊二醛溶液浓度的确定 活化剂的浓度影响壳聚糖上氨基的活化程度， 而且活化剂的浓度高低亦影响着酶蛋白的失活程 度。本文作者比较了不同浓度戊二醛溶液对固定化 酶活及回收率的影响，结果见图1。 图1 戊二醛溶液浓度（质量分数） 对固定化酶活和回收率的影响 试验结果表明，随着戊二醛溶液浓度的增大， 固定化酶的酶活下降。这可能是因为戊二醛会使酶 蛋白失活，从而导致酶活降低［10］。用该种方法活 化壳聚糖颗粒，戊二醛溶液的质量分数为1 %时固 定化的酶活及回收率最高。 2. 1. 3 活化剂戊二醛溶液pH 值的影响 分别用KH2PO4 - K2HPO4 的缓冲溶液调制出 不同pH 值的戊二醛溶液与壳聚糖反应，比较戊二 醛溶液在不同pH 值下对固定化酶的酶活及回收率 的影响，结果见图2。 由图2 可知，戊二醛溶液活化壳聚糖的pH 值 在中性和弱碱性范围内，随着戊二醛溶液pH 值的 上升，酶活和回收率也上升。相交点综合了酶活、 回收率两个因素，此时戊二醛溶液的pH 值为8. 2， 所以戊二醛溶液的 pH 值为 8. 2 时固定化效果 最佳。 ·281· 化 工 进 展 2004 年第23 卷 图2 戊二醛溶液的pH 值对固定化酶活和 回收率的影响 2.2 活化载体固定化酶条件的确定 2. 2. 1 固化时间的影响 由表2 可知，当固定化时间为4 h 时，由于固 定化时间短，游离酶基本没有固定上去，滤液的酶 活很高，结合酶量小。在固化时间为8 !12 h 内， 随着固化时间的加大，回收率亦加大。固定化的时 间以12 h 最佳，此时的酶活和回收率均较高。当 时间再加长，酶与戊二醛的结合不再占主要因素， 酶在该固定化环境中的失活比例增高，滤液酶活有 所下降，此时延长固定化时间，酶活不再增加。因 此固定化时间以8!12 h 为宜。 表2 固定化时间对固定化酶活的影响 时间／h 滤液酶活 ／U·h -1·g -1 结合酶量 ／U·h -1·g -1 固定化酶活 ／U·h -1·g -1 回收率 ／% 4 198. 75 46 647. 83 23 958. 33 51. 36 8 173. 75 83 026. 99 29 491. 19 35. 52 12 181. 25 73 194. 91 35 221. 39 48. 12 16 170. 00 54 730. 59 23 364. 49 42. 69 20 176. 25 75 636. 56 21 306. 82 28. 17 注：酶液用量10 mL，游离酶活5 804 U／（h·mL），固定化酶 pH 值为7. 8，固定化温度27 C。 2. 2. 2 固定化温度的影响 由表3 可以看出，温度对固定化酶活性的影响 很大。温度太低，活化载体与酶反应活性低，结合 率小，残余液的酶活性高；温度超过34 C后，酶 活性呈下降趋势，尤其在40 C以上，无论是酶的 活性还是回收率都为0。这是因为高温条件使游离 酶失活，所以固定化温度以27 C为佳。 表3 不同固定化温度对固定化酶活及回收率的影响 温度 ／C 结合酶量 ／U·h -1·g -1 固定化酶活 ／U·h -1·g -1 回收率 ／% 23 22 897. 54 192. 75 35. 16 27 39 762. 87 180 52. 72 34 42 96. 17 35 7. 09 40 0 0 0 注：酶液用量5 mL，游离酶活5 804 U／（h·mL），固定化酶 pH 值为7. 8。 2. 2. 3 固定化的最佳pH 值 固定化的pH 值影响载体和酶的游离状态，从 而影响着酶的结合量，造成酶固定化效率的差异。 表4 所示为不同固定化pH 值时酶活和回收率。 表4 pH值对固定化酶活和回收率的影响 pH 值 固定化酶活／U·h -1·g -1 回收率／% 6. 7 25 670. 28 40. 30 7. 4 27 142. 02 37. 25 8. 5 19 867. 12 36. 17 注：酶液用量10 mL，游离酶活5 804 U／（h·mL），固定化时 间12 h，固定化温度27 C。 由表4 可知，固定化的pH 值为6. 7!7. 4 时， 固定化的酶活和回收率均较高；当 pH 值为 8. 5 时，固定化的酶活有些偏低。故本文作者选用pH 值为6. 7!7. 4 固定化青霉素酰化酶。 2.3 载体结合酶量与回收率 由图3 所示，固定化酶的酶活随着酶用量的增 加而升高，但回收率随着酶用量的增加反而下降。 相交点综合了酶活、回收率两个因素，所以酶用量 以10 mL 最佳。 图3 不同酶量对固定化酶活和回收率的影响 3 结 论 试验结果表明，采用多孔壳聚糖颗粒固定化青 霉素酰化酶，用戊二醛作为活化剂活化壳聚糖效果 较甲醛、乙二醛好。活化壳聚糖时，以1 % 的戊二 醛溶液（pH值为8. 2）、酶固定化温度为27 C、固定 化酶pH值为7. 4、固定化时间为8!12 h 为最适条 件，固定化青霉素酰化酶的酶活和回收率较高。 参 考 文 献 1 BahLlekar R V，PrabhLme A A，SivaRamam H，et al . ［J ］. 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The matri x was crossli nked by glutaraldehyde，f or maldehyde and glyoxylaldehyde respecti vely . Glutaraldehyde was much better t han t he ot her reagents to crossli nk t he ami no of chitosan to i mmobilize PA. Some f actors t hat aff ected t he acti vit y of i mmobilized PA，such as concentration and pH of glutaraldehyde， temperat ure，pH，ti me，and Cuantity of PA for i mmobilizi ng were studied . Under opti mum conditions，t he acti vit y and yield of i mmobilized PA were 4 U／g·h（dry weight ）and around 5 % respecti vely . Keywords chitosan，penicilli n acylase，i mmobilized enzyme !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! （编辑 胡晓丹） ·新闻荟萃· 吉林石化分公司研究院滴流床反应器获国家专利 由吉林石化分公司研究院与大连理工大学共同研制的 滴流床反应器（专利号： 2238284 .4）日前获国家实用新型 专利。 这种滴流床反应器为气固液三相反应器，一般为绝热 式，在液相加氢中应用较多。对于列管式滴床反应器，由 于设备结构比较复杂，特别是对于低流带列管式滴流床反 应器的研究尚未见报道。列管式滴流床反应器适用于温度 变化比较窄反应过程，要求反应器换热效果好，每个反应 管内流体流量一致，并且沿反应管轴向不同截面流体分布 均匀。所以，反应器分布器的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 极为重要。该发明可以 很好解决滴流床液相加氢反应过程中放热较大、最佳反应温 度区间窄的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，从而提高反应效果，延长生产周期。 （张晓君、宋立新 供稿） 长效无滴膜专用料通过省级鉴定 一项具有国内领先水平的科研新成果———长效无滴膜 专用料技术开发，日前由吉林石化研究院与长春应化所共 同开发成功，并通过吉林省科技厅组织的专家技术鉴定。 农用塑料薄膜自2 世纪7 年代引入中国后，为粮食 生产和菜篮子工程做出了重大贡献。其中农用流滴膜的生 产与应用发展较快，因此长效流滴膜的应用前景极为广 泛。中国目前应用的内添加型聚乙烯流滴膜的流滴期仅为 3!4 个月，国外可达到与防老化寿命同步，差距较大， 无法满足中国农业生产发展的需要。 这种长效无滴膜专用料，经国家认定的检测部门检 测，达到了预定技术指标；经在国内大型农用膜生产企业 应用试验证明，各项性能与商品化的对照膜料相同，无滴 期与内添加法生产的无滴膜相比延长2!3 倍，可达13 个 月；添加助剂对无滴期无影响，专用料基本无凝胶；户外 扣棚试验效果良好。 专家认为，所提供的鉴定资料完整，数据准确可靠， 项目整体水平达到国内领先。该项成果的产业化将为专用 料生产企业带来显著的经济效益，也将为中国农业增产和 农民增收做出贡献。 （张晓君、宋立新 供稿） !- 亚麻酸乙酯新工艺开发成功 据报道，中科院新疆理化技术研究所新疆精细化工工 程技术研究中心承担的“生产"- 亚麻酸乙酯新工艺”项 目通过新疆维吾尔自治区科技厅的鉴定。!- 亚麻酸乙酯 除具有降血脂、降胆固醇、降血压、抗癌等功能外，还可 预防过敏性疾病，并具有促生长的功效，市场前景广阔。 !- 亚麻酸乙酯生产新工艺是该中心针对新疆地区的优势 资源———亚麻油利用并结合市场需求开展的技术创新项 目。科研人员在以前的尿素包结法生产!- 亚麻酸的工艺 技术基础上，结合先进的薄膜蒸发技术和分子蒸馏技术， 研究开发了生产!- 亚麻酸乙酯的新工艺。采用该工艺生 产的高品质!- 亚麻酸乙酯，达到了国外产品的质量标 准。该工艺技术路线合理，推广意义重大，技术达到国内 领先水平。 （摘自“中国化工在线”www. chemsi na . com） ·481· 化 工 进 展 2 4 年第23 卷 F1: