DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察.DNA是主要的遗传物质，主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。一、实验目的1了解Feulgen反应的基本原理。2熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。3掌握细胞分裂各期的主要特点。.二、实验原理DNA经弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而
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了Feulgen反应的专一性。.三、试剂1.Carnoy固定液：3份95%酒精加入1份冰醋酸。2.1mol/LHCL：准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到93.8ml蒸馏水中。3.Schiff试剂：称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1N HCl 20ml，继续冷却至25℃，加入1g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。.4.亚硫酸水溶液(漂白液)：在200ml蒸馏水中，加入10ml 1N HCl 和10ml 10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g固体）。此液在临用前配制。否则会因SO2的的逸出而失效。5.5%三氯乙酸6.0.5%固绿酒精溶液（95%的酒精溶解）.四、实验材料及实验器材1.材料Carnoy液固定的洋葱根尖2.实验器材显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、剪刀、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。.五、实验方法和步骤（一）材料准备 取洋葱头若干，剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长1cm时，剪下根尖固定在Carnoy固定液内、保存备用。（二）水解 实验时，取出预先准备好的洋葱根尖，用自来水漂洗后，置于3ml1mol/L HCl中，在60±0.5℃恒温水浴锅中水解8-15分钟。然后吸去热1mol/LHCl，再用自来水将根尖洗3次。水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。.预处理：切取长约5mm的植物根尖，加入Carnoy固定液固定2小时以上。样品可以转入70%酒精中长期保存。.将根尖放入1mol/L的盐酸中，60℃水浴，恒温条件下解离8~15min。.（三）染色 吸净水分，加入Schiff试剂避光染色40min~60min，用亚硫酸水漂洗2～3次，每次5min，然后经自来水流水冲洗干净后准备压片。（四）压片法 取一根尖置于载玻片上，用切下生长区部位（染成紫红色），加盖玻片，用拇指或铅笔的橡皮头轻压使细胞分散均匀，镜检。（五）对照组预先用5%三氯醋酸（90℃）处理15min，然后再依次进行实验步骤（二）（三）（四）。.染色后倒出Schiff试剂，亚硫酸水漂洗2～3次，每次3~5min，自来水漂洗干净，盖上盖玻片。.用镊子或铅笔轻轻敲打，使根尖细胞分散开。.六、有丝分裂各期观察洋葱根尖压片的观察首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形态，注意在你的片子上，是否有有丝分裂细胞，如有，你能找到细胞分裂期的几个阶段，其特征如何？（可参照附录）.实验结果.附录：植物细胞分裂的几个时期。细胞周期分为间期及分裂期，按照有无核膜，核仁、染色体，以及染色体形态与分布位置的变化，细胞有丝分裂又分为前期、中期、后期和末期四个阶段。现将各期特点简述如下，（1）前期：此期的染色质螺旋盘绕成一定数目的细而长的染色丝，此即染色体。染色体先是分散于核液中，以后，逐渐向核膜移动，在此时，核仁逐渐消失，核膜溶解。（2）中期：染色体进一步盘绕，变短变粗，在细胞的中央（即赤道板）规则地排列成行，仔细观察，可看到染色体两侧的纺锤丝。 .（3）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚，细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。（4）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开，此时，核仁、核膜又重新出现。此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内结构均匀，除异染色质外，可见1－2个着色较深的核仁。而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。.植物细胞的细胞质分裂..七、Feulgen方法应注意的几个问
题
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：1.对照压片的制做进行Feulgen反应时,一般要做一对照压片以便说明实验结果的真实性。对照压片的材料应在酸解前预先用5%三氯醋酸（90℃）处理15min，然后再依次进行酸解、染色和压片等。.2.固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。.3.水解时间Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够,反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。如用Carnoy固定液固定的材料，水解时间一般在8~15min之间。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。.4.Schiff试剂的作用Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。配好的Schiff试剂须在5℃以下冰箱内避光保存。.5.漂白液的重要性：漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前临时配制，以便保持较浓的SO2。6.操作过程中，用镊子镊取根尖的生长区部位，切勿夹取根冠部位。注意事项不要把染液滴加到桌面上.八、思考题1.说明Feulgen反应中设立的对照组的必要性。2.Schiff试剂的主要作用是什么?3.酸水解的作用是什么？.
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