细胞培养步骤

花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养细胞培养准备工作准备工作的内容包括器皿的冲洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。详细工作如下：一、冲洗（1）常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀、解剖针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、离心管、细胞冻存管、酒精灯、试管架、超净工作台、倒置显微镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封口膜、喷壶、以及洗刷用品等。（2）玻璃器皿冲洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶（瓶盖不泡盐酸，冲洗赶紧后直接高压灭菌）等玻璃器皿自来水刷洗，除掉尘埃，烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除掉脏物、铅、砷等物。泡盐酸12小时后立刻用自来水冲刷，再用洗涤剂刷洗，自来水冲洁净，然后用蒸馏水冲刷洁净后用烤箱烘干，高压灭菌，烘干备用。（3）塑料器皿的冲洗：细胞培养皿、培养板、培养瓶能够直接使用，入口枪头、入口离心管高压灭菌。（4）金属制品的冲洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲洁净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲刷，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。（5）棉织品：纱布和脱脂棉，高压灭菌，再烘干备用。二、溶液配制（1）PBS：配方一----用电子天平正确称取NaCl/8.0g，KCl/0.2g，KH2P04/0.29g，Na2HP04-12H20/1.42g溶于800mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。配方二----等渗0.01MPBS（1XPBS）细胞培养用，用电子天平准确称取NaCl/8.00g浓度为8/58.5=0.13675M，本配方主要靠NaCl，KCl/0.20g浓度为0.2/74.5=0.00268M，Na2HPO4·12H2O/2.90g浓度为2.90/358=0.0081M，Na2HPO4·2H2O/1.44g浓度为2.90/358=0.0081M，KH2PO4/0.24g浓度为0.25/136=0.0019M，溶于800mL的dddH2O，用玻璃棒搅拌至溶解，dddH2O定容至1000ml。置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。配方三----用电子天平正确称取NaCl/8.0g，KCl/0.2g，KH2P04/0.2g，Na2HPO4-7H20/2.16g，MgCL2·6H2O/0.1g，CaCL2/0.1g溶于800mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。（2）0.25%胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末（1：250）0.25g，用PBS在容量瓶中定容至100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。（3）0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液：正确称取0.25g的Trypsin和0.02g的EDTA，用PBS在容量瓶中定容至100ml，调节pH值为，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，用2mL的离心管分装，冻存于-20℃冰箱备用。（4）培养基：基础培养基MEM，这是使用最为宽泛的培养基；完全培养基配置方法为：1LMEM基础培养基增添4.76gHEPES充分溶解后，用NaOH將PH调到7.4，加2ng/mlbFGF，20%小牛血清，1mmol/L的L-谷氨酸，50mmol/L的2-巯基乙醇，100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素。（5）HEPES溶液：配置100×贮存液（1mol/L），在99ml培养液中加入1ml贮存液，使最终浓度任为10mmol/L。100×贮存液（1mol/L）配置方法：取23.8gHEPES溶于90ml双蒸水中，用1mol/LNaOH调PH至7.5~8.0，然后用水定容至100ml，过滤除菌，分装2ml小瓶，4℃或-20℃保存。三、培养室的灭菌（1）室内灭菌：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用新洁尔灭擦拭。（2）生化培养箱灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用70％酒精擦拭，再用紫外灯照射。保持培养箱内空气洁净，定期消毒。定期改换蒸馏水。（3）实验前灭菌：翻开紫外灯20-30分钟。（4）实验后灭菌：用70％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台，翻开紫外线照射20-30min。四、实验人员的无菌准备：（1）肥皂洗手。（2）穿好隔绝衣、带好隔绝帽、口罩、穿好鞋套。（3）戴乳胶手套，75％酒精擦手。五、无菌操作（1）凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用70％酒精擦拭瓶子的外表面。（2）凑近酒精灯火焰操作。（3）翻开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口邻近。（4）无菌级；别高的物品不能触碰无菌级别低的物品。手不能从敞开的瓶口上方经过。（5）各样操作要凑近酒精灯，动作要轻、正确，不能乱碰。如吸管不能遇到废液缸。（6）吸取两种以上的使用液时要注意改换吸管，防备交错污染。（7）手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端。（8）尽可能移走不需要的物品，在操作中经常用酒精擦拭台面。（9）尽可能减少开盖时间。（10）随时擦去任何溢出物。六、原代细胞培养方法一：组织块培养法（主要用于肌肉组织的培养）（1）选用身体健康，无病的幼鱼，用解剖针进行头颅穿刺法杀鱼，70%酒精消毒体表，然后放在无菌的培养皿中，待用。（2）解剖鱼体，拿入无菌操作台中，用无尘纸垫在鱼体下，用直头解剖剪剔除皮肤，取体表肌肉组织，然后剥去内脏膜取肝脏组织并刮去多余的外膜，放入培养皿，用PBS冲洗三遍，放入70%酒精中消毒3~4mim，再用PBS冲洗3遍，除掉血块，用加入双抗的无血清培养基冲洗一遍。（3）切割组织块，用解剖刀在培养皿上切割组织，切割过程中，加入适量的培养液保持组织润湿。（4）悬浮移瓶，切割达成后用新鲜的培养基悬浮小组织块，用移液枪移入培养瓶中，吸弃上清液，保存少量培养液，盖上瓶盖，轻轻晃动瓶子，使组织块在瓶底平均铺展开，用玻璃棒调整组织块使其平均散布，组织块间隔0.5cm为宜，25cm2培养瓶中加入20~30个组织块。（5）细胞贴壁，將培养瓶在培养箱中平放2小时，使组织贴壁，然后侧放半个小时，使液体浸出，然后吸出液体。（6）细胞培养，从培养瓶边角加入3ml培养基，盖上瓶盖，满满放入培养箱中平放培养。如有悬浮，需从头贴壁。（7）初始培养5天后换一次培养基，后期每隔2-4天换一次培养基。换培养基的时候，吸走一半旧的培养基，再加入一半新的培养基。（8）察看、记录细胞迁出情况，适时拍照。1~3天内迁出较少，尽量不要察看。方法二：酶消化解离法（除肌肉和结缔组织之外）（1）选用身体健康，无病的幼鱼，用解剖针进行头颅穿刺法杀鱼，70%酒精消毒体表，然后放在无菌的培养皿中，待用。（2）解剖鱼体，拿入无菌操作台中，用无尘纸垫在鱼体下，用解剖剪翻开腹腔（注意不能碰破肠道），剥去内脏膜取肝脏组织并刮去多余的外膜，放入培养皿，用PBS冲洗三遍，放入70%酒精中消毒3~4mim，再用PBS冲洗3遍，除掉血块，使肝脏呈灰白色，用加入双抗的无血清培养基冲洗一遍。（3）胰酶消化，将组织切割成1mm3大小，用1ml0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化20min后增添3ml完全培养基终止消化，收集含有组织块的细胞悬液，以2200rpm离心2min；将所得积淀用1ml完全培养基悬浮后接种在25cm2培养瓶中，培养温度为24℃。24h后增添1ml完全培养基至培养瓶。每隔7天换一次培养基。（4）当从组织块迁移出的细胞停止生长时，用0.25%胰酶消化混淆液消化细胞后，在原培养瓶持续培养，并在新鲜培养基中增添一半旧培养基。如此重复传代若干次，直至细胞长满培养瓶后按照旧规方法以1：2比率传代。（5）