miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞分化的影响

赵佳福， 游敏芳， 谌颖莲， 吴小敏， 倪 锴

(1. 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 3. 贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

脂肪是动物体的重要储能物质，与机体能量平衡相关，脂肪在动物体内的分布和含量影响肉产品的品质和风味[1]。脂肪主要是由中胚层的特化细胞群分化而来，其分化是1个复杂的调控过程，伴随着细胞结构和功能的改变，受到PPARγ、C/EBPα等多种转录因子和PKA(Protein kinase A system)、MAKP(Mitogen-activated protein kinase)等信号通路的调控[2]。其中脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase，LPL)是影响脂肪沉积的关键酶之一[3]，由脏器实质细胞粗面内质网合成和分泌，相对分子量为60 kD的糖蛋白。新转录合成的LPL是无活性的酶前体，活化后的LPL作为脂质吸收、转运、清除及脂质代谢过程中的关键酶，能将富含甘油三酯(TG)的乳糜微粒(Chylomicron，CM)、低密度脂蛋白(Low-density lipoproteins，LDL)与极低密度脂蛋白(Very low-density lipoproteins，VLDL)水解为游离脂肪酸和单酰甘油[4]，此外还能清除体内过多的甘油三酯，能将血浆中富含脂质的脂蛋白降解，是影响脂肪沉积的关键蛋白[5，6]。本试验前期研究发现，在猪脂肪前体细胞分化早期(0～72 h)，LPL基因表达量的高低与脂肪细胞的分化成正比，可以作为脂肪细胞分化的重要标记基因[7]。此外本课题组采用miRsystem在线软件预测发现，miRNA-27b-3p也可以靶向调控LPL基因的表达。近几年的研究发现，脂肪代谢还受到miRNA的调控。miRNA由Rosalind C.Lee等在秀丽隐杆线虫中发现，可以与Line4基因的3’非翻译区形成互补序列，从而抑制该基因的表达。miRNA是1类长度约20个核苷酸的小RNA，通过与靶基因非编码区(3’UTR)结合，抑制靶基因的表达，在控制生物发育、机体代谢[8，9]、细胞凋亡、细胞分化[10]、细胞增殖、免疫炎症和肿瘤发生等过程具有重要的调节作用[11，12]。在脂肪沉积方面，miRNA-27、miRNA-34、miRNA-130家族中多个成员都参与了脂肪沉积的调控，如miRNA-27b被确定为人和小鼠重要的脂肪代谢调控因子，能够调节几种关键的脂质代谢基因的表达[13]；猪肌内脂肪细胞中，miRNA-34c通过在转录水平和蛋白质水平抑制PPARγ、FABP4、FASN的表达，抑制猪肌内脂肪细胞的分化[14]。在对非酒精性脂肪肝的研究中发现，miRNA-27b-3p能显著促进3T3-L1细胞的脂肪细胞分化，并与脂质积累和细胞内甘油三酯含量有关，而且上调miRNA-27b可通过诱导酰基辅酶a硫酯酶2的表达促进脂肪细胞分化[15]。然而，miRNA-27b-3p是否也参与猪脂肪前体细胞分化目前还不清楚。本试验通过检测猪脂肪前体细胞中miRNA-27b-3p对LPL基因mRNA和蛋白质表达的影响，研究其对猪脂肪前体细胞分化的作用，为后续研究miRNA-27b-3p在脂肪沉积中的调控机制奠定基础。

1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载

1.1 试验材料猪脂肪前体细胞，由本课题组分离并经过油红O染色鉴定。

1.2 主要试剂TRIzol试剂、反转录试剂盒(赛默飞)，SYBR荧光定量PCR试剂盒(凯杰生物)，2×EsTaqMasterMix(康为世纪生物科技有限公司)，FuGENE®HD转染试剂(罗氏公司)，DMEM培养基、Opti-MEM培养基®(Gibco)，优质胎牛血清(ScienCell)，胰蛋白酶(Hyclone)，RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)，猪脂蛋白酯酶酶联免疫试剂盒(Andy gene)。

1.3 主要仪器梯度PCR仪(ABI，VeritiTM)、实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD，CFX96)、凝胶成像系统(BioRad，UniversalHoodⅡ)、倒置荧光显微操作系统(Nikon，Ti-S)、多功能酶标仪(BioTek，Synergy H1)、二氧化碳培养箱(Thermo，Midi40)、超微量紫外分光光度计(Thermo，NanoDrop 2000)。

1.4 方法

1.4.1 miRNA模拟物和荧光定量引物的合成利用在线软件miRsystem(http：//mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/)预测与miRNA-27b-3p具有靶向调控关系的候选靶基因，最终选择与猪脂肪前体细胞分化相关的LPL基因为研究对象。miRNA-27b-3p 模拟物(GCGGCATTCACAGTGGCT)、阴性对照(Negative control，NC)由上海吉玛基因公司合成。根据GenBank中猪LPL基因mRNA序列(NM_214286.1)，采用Primer Premier 5.0软件设计LPL基因荧光定量PCR引物，以GAPDH作为内参基因，设计引物送上海英骏生物技术有限公司合成。引物信息见表1。

表1 荧光定量PCR引物信息

1.4.2 猪脂肪前体细胞的培养及转染(1)细胞培养：从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速37 ℃水浴解冻，细胞解冻后采用含10%FBS的DMEM完全培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞长至细胞瓶壁90%左右进行传代培养。(2)细胞转染：为确保后续试验中RNA和蛋白质的提取量，试验采用6孔细胞培养板铺板，待细胞达到80%丰度时开始转染。分别设计试验组和对照组，每组3个重复，各组加样体系如下。试验组：miRNA-27b-3p 模拟物 5 μL，脂质体10 μL， Opti-MEM培养基100 μL；对照组：NC 5 μL，脂质体10 μL，Opti-MEM 培养基100 μL。转染步骤参照FuGENE®HD 转染试剂 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 方法进行。转染结束后将培养板置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，转染24、48 h后进行RNA提取、ELISA试验和甘油三酯检测。以上试验重复3次：第1次试验所有细胞用于提取总RNA，进行荧光定量PCR试验；第2次试验用于提取细胞总蛋白，进行ELISA试验；第3次试验用于细胞中甘油三酯的检测。

1.4.3 细胞中总RNA的提取及反转录转染24、48 h后，将转染不同样品的细胞用预冷PBS清洗3次，然后参照TRIzol试剂提取说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行各组细胞总RNA的提取。提取完成后，采用超微量紫外可见分光光度计检测RNA的浓度和纯度，根据检测结果将转染不同样品的总RNA终浓度稀释至120 ng/μL，随后参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得的反转录产物直接用于荧光定量PCR 试验。

1.4.4 实时荧光定量PCR以GAPDH基因作为内参基因，以QuantFastTMSYBR®Green PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，每个样品设3个重复。反应体系10 μL：PCR Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.7 μL，ddH2O 3.3 μL。根据事先确定的LPL基因与内参基因的最佳退火温度设置反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环；95 ℃终延伸0.5 s。反应结束后以熔解曲线检测扩增过程中引物的特异性。

1.4.5 细胞总蛋白的提取及ELISA 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 (1)细胞蛋白提取：为防止蛋白降解，在提取细胞总蛋白前，在RIPA裂解液1 mL中加入PMSF 50 μL。然后用预冷PBS清洗细胞孔3次，每孔加入RIPA裂解混合液150 μL，冰上裂解30 min，期间采用200 μL移液器反复吹打3～5次，然后将3个裂解相同样品的细胞悬液收集至1支新的Eppendorf管中(1.5 mL)，4 ℃ 13 000 r/min离心2 min，将上清转移至1支新的离心管中，用于ELISA试验或置于-80 ℃冰箱保存备用。(2)ELISA试验：根据BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明书配制BCA工作液，稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品和待测蛋白样品，用多功能酶标仪测定A562 nm吸光值(D562 nm)。根据标准品吸光值和稀释浓度制作标准曲线，根据标准曲线分别计算出待测样品蛋白浓度。根据猪脂蛋白酯酶联免疫试剂盒的检测范围稀释蛋白浓度。

1.4.6 细胞中甘油三酯含量的测定由于LPL在将甘油三酯水解为游离脂肪酸和单酰甘油的过程中扮演了限速酶的作用，因此可以通过检测细胞中甘油三酯的含量判断LPL的表达量。测定步骤如下：分别转染miRNA-27b-3p和对照组24、48 h后 ，将不同转染组细胞用预冷PBS清洗3次，再参照甘油三酯检测试剂盒说明书处理细胞，每组3个重复。将处理好的细胞按以下程序加样。空白组：蒸馏水10 μL+工作液1 000 μL；校准组：校准品10 μL+工作液1 000 μL；样品组：样品10 μL+工作液1 000 μL。加好样后混匀，37 ℃孵育10 min，用酶标仪测定D562 nm值。甘油三酯含量(mmol/L)=(样品D562 nm-空白D562 nm)÷(校准D562 nm- 空白D562 nm)×校准品浓度(mmol/L)÷待测样品蛋白浓度(gprot/L)。

1.4.7 数据统计(1)qRT-PCR：获得试验组和对照组Ct值后，采用2-△△Ct法分析LPL基因在对照组和试验组中的相对表达量，试验数据用“平均值±标准误”表示。△Ct(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。(2)ELISA试验和甘油三酯检测：试验数据用“平均值±标准误”表示，最后采用SPSS Statistics 17.0 数据分析软件和Graphpad Prism 5 图形分析软件分别进行相关数据的统计分析和图表处理。

2 结果与分析

2.1 miRNA-27b-3p在转录水平对LPL基因表达量的影响以GAPDH基因作为qRT-PCR试验的内参基因，得到LPL基因和GAPDH基因表达量的熔解曲线图(见图1)。结果显示：目的基因LPL和内参基因GAPDH的扩增曲线拐点清晰，斜率较高，均呈现S型，表明结果较好，扩增效率较高；熔解曲线均为光滑的单峰曲线，且退火温度附近无明显杂峰，说明引物特异性、重复性好，无引物二聚体出现，符合试验要求。qRT-PCR结果显示：miRNA-27b-3p转染24 h后细胞中LPL基因的表达量被显著抑制，与对照组相比差异极显著(P

A BA.扩增曲线：左侧为GAPDH基因扩增曲线，右侧为LPL基因扩增曲线； B.熔解曲线：左侧为GAPDH基因熔解曲线，右侧为LPL基因熔解曲线图1 LPL基因的扩增曲线和熔解曲线

**表示差异极显著(P

2.2 miRNA-27b-3p在翻译水平对LPL蛋白表达量的影响ELISA试验结果显示：在猪脂肪前体细胞中转染miRNA-27b-3p 24、48 h后对细胞中的LPL蛋白表达量均有极显著抑制作用(P<0.01)(见图3)。

2.3 miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞中甘油三酯含量的影响甘油三酯测定结果显示：转染miRNA-27b-3p 24、48 h后对猪脂肪前体细胞中甘油三酯的表达量均有极显著抑制作用(P<0.01)(见图4)。

3 结论

miRNA-27b-3p通过靶向作用降低LPL基因的表达，抑制猪脂肪前体细胞的分化，进而影响脂肪的形成。

4 讨论

4.1成熟的脂肪细胞是由脂肪前体细胞分化而来，而脂肪前体细胞在转化为成熟脂肪细胞的过程中，先后需要经过细胞增殖、生长停滞和终末分化几个阶段，而这一转化过程受诸多调控因子的影响。近年来的研究发现，miRNA在脂肪分化过程中发挥着重要的作用。如：miRNA-130b可与PPARγ、C/EBP-β3基因的3’UTR端结合，降低其mRNA水平，从而抑制猪脂肪的沉积[15，16]；miRNA-425-5p在猪骨骼肌中富集，在猪肌内脂肪前体细胞中miRNA-425-5p下调PPARγ、FABP4、FASN的表达，从而抑制肌内脂肪细胞的分化[17]；同样在猪脂肪前体细胞中miRNA-34a可通过靶向抑制ACSL4基因的表达来促进脂肪细胞的增殖分化，导致脂肪细胞脂滴含量的积累增多[18]；其次miRNA-34c可与E2F3和KLF4基因靶向结合，过表达miRNA-34c导致猪脂肪前体细胞中的PPARγ、FABP4、FASN的mRNA与蛋白均被显著下调，抑制脂肪细胞的增殖与分化[14]。除此之外，miRNA-27家族的多个成员已经被证实在脂肪沉积中具有重要调控作用。如：3T3-L1细胞中，miRNA-27a通过结合PPARγ基因非翻译区来阻遏下游多种脂肪生成的标志基因脂联素、CD36、LPL的表达，从而抑制脂肪细胞的分化[19]；另外对大鼠肝星状细胞(HSCs)的研究发现，视黄醇X受体a(RXRa)被证实是miRNA-27a和miRNA-27b的靶点，miRNA-27a和miRNA-27b可以通过靶向RXRa基因进而调节HSCs脂肪代谢和细胞增殖[20]。

4.2鉴于miRNA-27家族在脂肪沉积中的重要作用，本试验通过miRsystem在线软件对miRNA-27b-3p的靶基因进行预测，结果发现LPL基因是miRNA-27b-3p的重要互作靶点。已有其他研究发现，LPL基因在脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化的过程中对脂肪酸代谢发挥了重要作用，尤其是在肌内脂肪合成时能控制脂肪和肌肉中甘油三酯的分配，控制肌内脂肪的沉积和代谢[21]，因此常被作为脂肪生成的重要标志基因。本试验通过在猪脂肪前体细胞中过表达miRNA-27b-3p，从转录水平和翻译水平观察miRNA-27b-3p的上调对LPL基因表达的影响，间接判断miRNA-27b-3p靶向调控LPL基因对脂肪前体细胞分化的影响，结果发现：miRNA-27b-3p的上调均在一定程度上抑制了LPL基因的表达，间接影响了细胞的分化。为了证明结果的可靠性，试验还观察了上调miRNA-27b-3p后对脂肪前体细胞中甘油三酯表达的影响，结果发现：上调miRNA-27b-3p后，脂肪前体细胞中甘油三酯的表达量均极显著降低。由于甘油三酯升高是脂肪细胞堆积的重要指标，因此从另一方面说明miRNA-27b-3p上调抑制了LPL基因的表达，间接抑制了脂肪前体细胞的分化和脂肪的生成。此外，随着对非编码RNA的研究发现，除了miRNA对脂肪分化存在调控作用，LncRNA(长链非编码RNA)也在脂肪调控中发挥重要作用[22，23]。本试验结果表明，miRNA-27b-3p可通过靶向降低LPL基因的表达，进而抑制猪脂肪前体细胞的分化与脂肪的形成。但是在此过程中是否有LncRNA参与这一调控过程目前还不清楚，因此关于LPL、miRNA-27b-3p及相关LncRNA共同调控猪脂肪前体细胞的分化还需进一步研究。

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