小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响.doc

小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响.doc 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 长沙环境保护职业技术学院毕业 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 姓 名: 学 号: 606073119 指导教师姓名: 蔡水文老师 指导教师姓名: 吕立获生物技术部主管 浙江普洛家园医药科技有限公司 系部名称: 环 境 科 学 系 专业名称: 生物技术及应用 班级名称: 0731班 论文提交日期: 2010年6月12号 1 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 目 录 摘要 …………………………………………………………………………………3 引言……………………………………………………………………………………4 1实验部分 …………………………………………………………………………4 1.1 实验材料……………………………………………………………………4 1.2 培养过程……………………………………………………………………4 1.3 测定方法……………………………………………………………………5 2 结果与分析………………………………………………………………………5 2.1 50 L发酵罐培养结果与分析………………………………………………5 3 结论 ………………………………………………………………………………9 参考文献 …………………………………………………………………………9 致 谢……………………………………………………………………………10 2 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 摘 要 单细胞绿藻在医疗保健、环境保护、生物能源领域等众多领域由很大的用途，并且具有很大的经济效益。但是现在在的小球藻生产工艺还欠成熟，主要问题是其产量不高发酵周期较长，因此如何高效培养出超高细胞浓度小球藻各个企业与实验室想突破的问题。小球藻培养是一个具有高度非线性、时变性和迟滞性的过程，其内在机理非常复杂，传统的培养方法难以实现对小球藻高产的目的，因此对培养、发酵过程进行优化培养很困难。本文主要研究的是对小球藻培养过程中流加与不流加葡萄糖、硝酸钾对小球藻发酵的影响。经过实验结果得知在对数生长期控制葡萄糖浓度与硝酸钾浓度在20g/L、2.2-2.5g/L可以大大提高生长速率与产量。 关键词:小球藻 培养;流加;葡萄糖;硝酸钾 3 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 引言 单细胞绿藻在水产养殖、环境保护、人类健康食品和重要生命活性物质生 产等众多领域的研究与应用得到不断扩展，而如何高效培养出超高细胞浓度小球 藻来满足各个应用领域的需要是我国急待解决的藻类生物技术关键课题。本文主 要针对小球藻的发酵培养流加碳源与氮源的研究，从而得出最佳流加浓度培养条 件达到高产的目的。 1实验部分 1.1实验材料 实验所用菌种是由华中理工大学提供，实验过程中采用食品级葡萄糖和分析 纯硝酸钾分别作为小球藻生长的碳源和氮源，其他所用试剂均为分析纯。 1.2 培养过程 首先采用三角瓶，在温度30?和摇床转速200 r,rain条件下异养批量培 养小球藻，培养3d左右后收获直接作为50 L半自控发酵罐的藻种。 在批量和发酵培养过程中所用培养基成分和含量均由华中理工大学自主研 制，初始pH为6(50左右。根据小球藻的不同生长期，采用700 g,L葡萄糖不 同量的流加，氮源、微量元素适情况添加。 实验所用培养基和容器均经过121?、30min的高温、高压灭菌，发酵培养的 控制条件是:温度为30?，灌压0.05Mp,50L、1.5 m3,(L?h) ，培养过程中根 据所消耗氧的量来调节通气量和电机频率进而提高氧的含量液中(培养液中氧的 含量不低于20%，否则无法正常生长)，调一次通气量调 一电机频率，交替进行。 4 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 测定方法 1.3 在发酵培养过程中，分不同时间间隔进行取样分析,浊度比色法,721型分光 光度计测定培养液在680nm处的吸光度(OD680)。糖浓度(G),在线可显示溶氧 (DO)、温度、灌压。 采用分光光度计。在波长680 nm下以去离子水作为参比，分别测定稀释不同 倍数小球藻发酵液的光密度，以此代表小球藻的生物量。小球藻发酵液中的葡萄 糖浓度和硝酸根浓度分别采用碘量法和离子色谱法测定。 2 结果与分析 2.1 50 L发酵罐培养结果 下面三个图是在50 L发酵罐中,采用流加葡萄糖和硝酸钾方式或将葡萄糖和 硝酸钾全部加入到初始培养基中2种不同条件下,小球藻的生长、发酵液中葡萄糖 浓度和硝酸钾浓度的变化过程。 5 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 90 80 70 -160 50 40 30 20葡萄糖质量浓度/g?L 10 0 0612182430364248 1-流加2-不流加 时间/h (a) 图1(a)显示了流加与不流加葡萄糖2种条件下,发酵液中葡萄糖浓度的变 化。采用不流加方式培养,初始葡萄糖质量浓度达到78/L，培养48 h后降低到 40/L，较高的葡萄糖浓度严重抑制了小球藻的生长，而根据小球藻不同生长期， 采用逐渐加大葡萄糖流加量方式培养，发酵液中葡萄糖质量浓度经历了前24 h 逐渐增加到19.8 g,L，此后逐渐降低到48 h的1.4/L的先增加后降低的变化过程， 但始终维持在20.0 g,L以内。实验48 h结束时葡萄糖已经基本消耗利用完,既保 证了小球藻生长的碳源所需，又没有对小球藻生长产生明显的抑制，因此采用分 3个不同速率、逐渐增加葡萄糖流加量是一种非常有效的小球藻异养发酵培养控 制方式。 6 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 140 120 100 80 680nm60 OD 40 20 0 0612182430364248 1-流加2-不流加 时间/h (b) 图l(b)显示,与初始将培养基所有成分全部加入相比,根据小球藻不同生长 期分3个速率流加葡萄糖和硝酸钾,可以明显提高小球藻的生长速度。采用不流加 方式培养，初始OD为4.3,48 h、OD为68.6,对应的平均生长速率为1.3OD,h.而采 用流加方式培养，初始OD为1.7，48 h、OD为128.8,对应的平均生长速率为2.6 OD ,h，同比提高100,，说明采用流加方式是高效快速培养出小球藻的优化控制条 件。根据建立的小球藻的细胞干重浓度与OD之间的线性关系[细胞干重浓度(g, L)=0.357OD]计算，培养48 h采用不流加碳、氮源方式获得小球藻细胞干重质量 浓度为24.5 g,L，而根据小球藻的不同生长期，分3个阶段流加碳、氮源方式培 养获得小球藻细胞干重质量浓度46.0 g,L。 7 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 14 12 -110 8 6 4 2 硝酸钾质量浓度/g?L0 0612182430364248 1-流加2-不流加 时间/h (c) 图1(c)显示了在流加与不流加硝酸钾条件下硝酸钾浓度的变化过程，其变 化趋势与葡萄糖浓度的变化类似。在不流加条件下，硝酸钾质量浓度从初始量 的11.4 g,L逐渐降低到48 h的6.2 g,L。而在流加条件下，硝酸钾质量浓度在 前30 h逐渐增加到2.6 g,L，以后逐渐降低，48 h降低到0.3 g,L以下。采用流 加方式既可以保证小球藻生长的氮源供给，同时也不会有较高浓度的硝酸钾积累 而抑制小球藻的生长。 以上结果表明随着小球藻生物量的逐渐增加,分3个阶段逐渐提高葡萄糖 和硝酸钾分别作为碳源和氮源的流加量,不仅可以大幅度提高小球藻的生长速 度,最高获得了干重质量浓度46.6 s,L的藻生物量,而且能够有效地利用提供 的碳氮源营养物质,同时还可以保持发酵液pH的基本稳定。 8 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 3 结论 本文采用华中理工大学提供小球藻作为藻种，在50 L发酵罐中培养，得 出的主要结论如下: (1)根据小球藻不同生长期，按照3个生长期分别逐渐加入不同量的葡萄糖 和硝酸钾量，实验结果可以发现当达到对数生长时控制糖浓度在20g/L,硝酸钾在 2g/L;比不流加生长速度提高l倍。在流加的培养条件下，56 h以内均获得了质 量浓度40 g,L以上的藻细胞干重，因此在发酵过程中流加碳源与氮源的培养方 法是一种高密度、高强度培养小球藻的优化控制方法。 (2)在小球藻异养发酵培养过程中，流加碳氮质量比为10:1的高浓度葡萄 糖和硝酸钾溶液，不仅能够明显提高小球藻的生长速度，而且可以维持发酵液的 pH基本稳定。 参考文献 1.周华伟.林炜铁.陈涛小球藻的异养培养及应用前景-氨基酸和生物 资源 2005(04) 2.闫海.张宾.王素琴小球藻异养培养的研究进展[期刊论文]-现代化工2007(04) 3.陈晓红碘量法测定葡萄糖含量微型实验研究[期刊论文]-光谱实室2006(06) 4.刘硕.许倩倩.张宾从异养小球藻USTB-01中提取纯化叶黄素研究 2007(02) 5.张大兵.吴庆余小球藻细胞的异养转换 1996(2) 6.季祥.张智慧.张雪艳.蔡禄小球藻培养条件的优化[期刊论文]-安徽农业科学 2009(34) 7.白秀峰(发酵工艺学(北京:中国医药科技出版社，2003 8.韩士群.张振华.刘海琴小球藻生长因子对免疫功能的影响-中国生化药物杂志 2004(01) 9.王长海海洋生化工程概论 2004 9 小球藻培养过程中流加碳源与氮源对其生长的影响 致 谢 光阴似箭，岁月如梭。三年的大学生活即将划上圆满的句号。这三年里，我 本人经历过不知所措的迷茫，也感受过豁然开朗的激动;有苦有乐，;我犹豫不 决过;我意气风发过;但是这一切已随风而逝，留下的是对过去的感激和对理想 的追求。 本文是在我的指导师蔡水文老师和普洛生物技术部主管吕立获的指导下完 成的。研究工作使我的知识越来越丰富。开阔了视野和丰富的经验指导我克服工 作中遇到的种种困难和挫折(从课题的选择，直至到论文的撰写和修改，蔡水文 老师和普洛生物技术部主管吕立获都给予我精心的指导并做了大量细致的工作。 蔡老师宽厚的为人，积极活跃的思维方式，积极乐观的生活态度，勇于探索的创 新精神，以及与学生讨论时的平易近人让我有着如沐春风的感受(从他身上学到 的这些，将对我以后的人生产生深远的影响，时刻激励我积极地面对此后的人 生(在此，谨向蔡老师和吕主管致以由衷的敬意! 同时我还要感谢一直帮助我的同学们，感谢父母对我的理解与支持～ 10