环境中微生物检测方法

环境中微生物检测方法微生物体积小、重量轻，因此可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步。微生物种类繁多，对外界环境的适应能力又很强，只要生活条件合适，它们就可以迅速繁殖起来。因此，它们是自然界分布最广的一群生物无论是南极、北极、高山、海洋、陆地、淡水，还是土壤、空气、动植物体内外，几乎到处都有它们的踪迹。空气、水是维持人类生命不可或缺的物质。它们直接进入人体或与人接触。如果带有病原微生物，将成为传染疾病的媒介。通过空气和水中微生物的检验，对环境质量进行控制。土壤中的微生物土壤是微生物生活的良好环境在自然界，土壤是微生物生活的良好环境。因为土壤具有微生物生长繁殖所必需的各种环境条件。1.1.1.1营养土壤中有大量动植物残体、植物根系的分泌物、人和动物的排泄物，这些有机物为微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中丰富的矿质元素可以满足微生物对矿质营养的要求。1.1.1.2水分和渗透压土壤中具有一定的持水性，可为微生物提供水分；土壤的渗透压对微生物是等渗或低渗环境，有利于微生物摄取营养。1.1.1.3空气土壤团粒结构中的小孔隙充满空气，土壤中氧的含量比大气少，平均为土壤空气体积的7%-8%。通气良好的土壤，氧的含量高些，有利于好氧微生物的生长。1.1.1.4pH值土壤的pH多接近中性，且缓冲能力强，适合大多数微生物生长的需要。在酸性或碱性的土壤中，亦有与之适应的微生物生长繁殖。1.1.1.5温度土壤还具有保温性，与空气相比，昼夜温差和季节温差要小得多。即使冬季地面冻结，一定深度的土壤中仍保持一定的温度。一般是10〜25°C，适宜多种微生物生长的需要。1.1.2土壤微生物的种类、数量及其分布土壤中微生物的种类和数量都很多。土壤中微生物的数量因土壤类型季节、土层深度与层次等不同而异。如有机物含量丰富的黑土、草甸土等肥沃土壤，微生物含量较高，每克土可含几亿至几十亿个微生物；而红壤棕钙土、盐土等贫瘠土壤，微生物的含量很少，每克土也含几百万至几千万个微生物。1.1.2.1微生物种类和数量土壤这中的微生物有细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等类群。其中细菌数量最多，放线菌和真菌次之，藻类和原生动物等的数量较少。（1）细菌约占土壤微生物总数的70%~90%，含量达每克土几百万个至几亿个，主要是异养型种类，少数为自养型。异养型种类积极参与土壤有机质的分解和腐殖质的合成。自养型种类转化着矿质养分的存在状态。土壤中常见的细菌有固氮细菌、氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸还原细菌、纤维素分解菌、假单胞菌、黄杆菌、钾细菌和铁细菌等。（2）放线菌约占土壤微生物总数的5%~30%，含量为每克土几千万至几亿个孢子。在偏碱性土壤中数量较多，都是异养型种类。放线菌较耐干旱，在潮湿土壤中比干旱土壤中少，在渍水条件下，如土壤持水量在80~100%时，放线菌很少出现。土壤中常见种类有诺卡氏菌属、链霉菌属和小单孢菌属。（3）真菌每克土壤中有真菌几千至几十万个，均为严格好氧的异养型种类。酵母菌的含量较少，一般为每克土壤几个到几千个。但在葡萄园和果园的土壤中，每克土壤酵母菌含量可达几十万个。真菌中的霉菌，以丝状体的菌丝交织曼延在土壤中起改良土壤团粒结构的作用。土壤中最常见的霉菌有青霉、曲霉、枝孢霉、头孢霉等。（4）藻类土壤中藻类的数量不多，不到微生物总数的1%，但分布却很普遍。一般生长在土壤表层，多为单细胞绿藻和硅藻。藻类为光合型微生物，受阳光及水分影响较大，土壤下层因无阳光，数量少。在温暖季节中，积水的土面上藻类大量发育，其中主要有衣藻、小球藻、丝藻及各种硅藻，水田内则发育有水绵等丝状绿藻，为土壤积累有机质。（5）原生动物在不同类型的土壤中数量变化很大，每克土壤有几十个至几十万个，在富含有机质的土壤中主要有纤毛虫、鞭毛虫、肉足虫等，大多数种类是异养型的，以吞食各种有机物的碎片、藻类、菌类等为生。土壤中的微生物是土壤的组成成分，通过它们的代谢活动，转化土壤中各种物质的状态，改变土壤的理化性质，是构成土壤肥力的重要因素。1.1.2.2微生物在土壤中的分布状况（1）水平分布土壤中微生物的水平分布取决于碳源，例如油田地区存在分解石油的微生物；林区存在大量分解纤维素的微生物；在动植物残体较多的土壤中则有较多的氨化细菌和硝化细菌。2）垂直分布土壤中微生物的垂直分布与紫外线的照射、营养、水、温度、通气等环境因子有关。表层土因受紫外线照射和缺乏水，微生物不易生存，在5~20cm的土层中处微生物数最多，随土层的加深，菌数减少，这是由于缺乏营养和氧气造成的。1.1.3土壤微生物的分离和计数多采用稀释平皿法，操作步骤如下：1.1.3.1取样选定取样区域，去表层土，按对角交叉取样法取五点土样混匀。称取10g混匀土样两份，一份用于制备土壤稀释液，另一份土样烘干至恒重(105°C,8h)，置于干燥器中冷却后称重。1.1.3.2制备土壤稀释液在含90mL无菌稀释水和玻璃珠的锥形瓶中加入土样10g，振荡10min,制成土壤悬浮液，将土壤悬浮液作10倍递减稀释至适当浓度。细菌采用10~10、放线菌采用10~10、霉菌采用10~10为适宜浓度。1.1.3.3混菌法接种取适当浓度的稀释菌悬液1mL加入无菌平皿，然后倒入合适的培养基趁热将菌液和培养基混匀。每个稀释度须做平行。如只进行分离而不计数，对土壤悬浮液可不作系列稀释，采用划线分离法或涂布分离法即可。1.1.3.4培养待培养基冷却后，倒置于培养箱中，在适宜的温度下培养相应的时间(细菌在37C下培养Id〜2d、放线菌和真菌则在28C下培养5d〜7d)。1.1.3.5计数计数平皿上出现的菌落。细菌和放线菌选取菌落数为30〜300的平皿真菌选取菌落数为10〜100的平皿进行计数。如需获取纯种，可取单个菌落进行试管斜面转接，培养后，选用适宜方法保存。－4－1－3－5－2－41.1.3.6计算每克干土含菌数每克干土含菌数=每克湿土含菌数某湿土重/干土重土壤中微生物的数量是土壤自净作用的基础，也是土壤生物修复的主力军。由于土壤有团粒结构，又栖息着数量庞大、种类繁多的微生物及其他生物，使土壤具有很强的吸附、过滤和生物降解能力。当污水和污物进入土壤后，先被土壤吸附，紧接着又被微生物及其他生物降解，使土壤逐渐恢复到原来的状态。1.2水体中的微生物水体可分为天然水体和人工水体。天然水体包括海洋、江河、湖泊等人工水体包括水库、运河、城市排水系统、各种污水处理系统等。水体中含有微生物所需的各种营养，因而也是微生物的天然生境。水体中微生物除天然栖息者外，还有来自土壤、空气、动植物残体、动物排泄物、各类工业废水和生活污水中的微生物，其中包括某些病原微生物。水中微生物的种类、分布微生物的种类（1）清水型水生微生物在洁净的水域中，因营养物较少，微生物数量也较少。在每毫升水中一般只含几十个到几百个细菌，并以自养型种类为主。常见的细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝细菌、柄细菌、赫色纤毛菌、球衣细菌和萤光假单胞菌等。此外，还有许多藻类（如丝状绿藻、硅藻等）、真菌（水霉菌属和绵霉菌属）、原生动物（如钟虫及其他固着型纤毛虫等）和后生动物（如枝角类、桡足类等）。（2）腐败型水生微生物在受到有机物严重污染的水域中，数量较多的是细菌，每毫升水中可达几千万个甚至几亿个，以异养菌为优势。异养菌分解有机物，起重要的净化作用。常见的微生物中，细菌以变形杆菌、产气肠杆菌、产气碱杆菌等革兰氏阴性无芽孢菌为主，此外还有芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、粪链球菌、弧菌、螺菌、假单胞菌，有的甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱等病原体；藻类有绿藻、裸藻等；原生动物有草履虫、屋滴虫、小口钟虫等微生物的分布影响微生物在水体中分布的因素有：水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、pH及水深等。微生物在水体中的水平分布规律为：近岸水域中细菌数量较多，离岸越远的地方，微生物越少；底泥中的细菌多于水中的细菌。微生物在较深较大的静水水域中的垂直分布规律是：在上层水体中（水面下0~10m深处），氧含量较高，主要有好氧细菌（如假单脆菌、柄杆菌、球衣细菌等）、真菌和藻类；中层水体（水深20~30m）主要有光合细菌（如红硫细菌和绿硫细菌）以及厌氧细菌；底层水体中（30m以下及湖底泥），主要有脱硫弧菌属、甲烷杆菌属和甲烷球菌属等厌氧细菌。微生物的数量以5~10m深处为最多，随着深度的增加而减少。地下水由于经过土壤过滤、有机物缺乏，故含菌量远远少于地面水，在深层地下水中甚至没有细菌。1.2.2水的细菌学检测1.2.2.1细菌总数（CFU）的测定细菌总数是将定量水样（原水样或作一定稀释后水样ImL）接种在普通营养琼脂培养基内，于37°C培养24h后观察结果，计数其上长出的细菌菌落数，然后换算求出原水样每mL中所含的细菌数。其测定步骤和土壤中微生物的分离计数方法基本相同，但须注意：①水样是用无菌采样瓶直接采取水样；②水样接种于营养琼脂培养基中，在37C下培养24h；在37C营养琼脂培养基中能生长的细菌，代表在人体温度下能繁殖的异养型细菌。细菌总数越多，说明水被有机物或粪便污染越重，被病原菌污染的可能性也越大。在生活饮用水中所测得的细菌总数，除说明水被生活废弃物污染的程度外，还可指示该水能否饮用。可在生活饮用水进行卫生学评价时提供依据。我国生活饮用水标准（GB5749-85）规定，细菌总数不得超过100个/ml。一般认为在天然水体中，如10〜100个/mL，为极清洁的水；100〜1000个/mL，为清洁的水；1000〜10000个/mL,为不太清洁的水；10000〜100000个/mL，为不清洁的水；大于100000个/mL，为极不清洁的水。大肠菌群的测定天然水体的细菌性污染主要源于生活污水中的粪便，即水中的病原菌很可能是肠道传染病的病原。通常情况下，水中病原菌的含量极少，而细菌种类却很多，需要耗费大量的人力、物力及复杂的分离培养技术，才能将病原菌一一检测出来。最常见的数量极大的大肠菌群与病原菌同样来自于动物粪便，根据这一点，只要通过检查水样中的指示菌一一大肠菌群，即可知道该水体被粪便污染的程度，从而间接推测其他病原菌存在的概率。大肠菌群是指那些能在37°C下，24~48h之内使乳糖发酵并产酸产气、好氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏菌、产气杆菌、枸橼酸盐杆菌、副大肠杆菌。大肠埃希氏菌即大肠杆菌是人和温血动物肠道中的正常细菌，兼性好氧的革兰氏阴性、无芽孢、两头钝圆的杆菌，大小0.5~0.8m某2.0~3.0m最适温度37C，最适的pH为中性；能分解葡萄糖、甘露醇、乳糖等多种碳水化合物，并产酸产气。大肠菌群的各类细菌的生理习性都相似，只是副大肠杆菌不分解或缓慢分解乳糖。在远滕氏培养基（品红亚硫酸钠培养基）或伊红美蓝培养基表面会形成具有特殊现象的菌落，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸橼酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落则无色透明。这些现象可作为鉴别的依据。