毕业设计（论文）-来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450-BM-3的蛋白质工程研究

毕业 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 （论文）-来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450-BM-3的蛋白质工程研究 本科毕业设计(论文) 题 目: 来源于巨大芽孢杆菌ALA2的 细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程研究 学 院: 专 业: 学 号: 学生姓名: 指导教师: 职 称: 年 月 日 摘 要 细胞色素P450酶系是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系。来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus. megaterium)的细胞色素P450 BM-3可以快速催化链长大约C12~C18的饱和脂肪酸的单加氧酶活性，其中对C15和C16脂肪酸的活性最高。 编码P450 BM-3的基因(CYP102)已被克隆并在大肠杆菌中得到表达，从大肠杆菌中表达的P450经纯化后与从巨大芽孢杆菌纯化的P450 BM-3有相同的功能、免疫化学和电泳特征，其N-末端序列也一致。 本实验采用来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450 BM-3基因进行蛋白质工程设计，按此依据进行定点突变和重组表达，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比。相比于野生型细胞色素P450 BM-3，F87L对吲哚显示了较高的活性，酶活提高约6.98 %，由此证明Phe87对反应选择性控制起着关键的作用，是影响该酶表达量和表达活力的主要因素。并为进一步探索体外合成的细胞色素P450 BM-3进行生物催化应用打下较好的基础。 关键词:巨大芽孢杆菌，P450 BM-3，F87L，吲哚 I The study on protein engineering of the cytochrome P450 BM-3 from B. megateriummALA2 Abstract Cytochrome P450 is a kind of metabolic enzymes which are widely distributed in animals, plants and microorganisms. Cytochrome P450 BM-3 from B. megateriumm shows high monooxygenase activity for long chain saturated fatty acid(12-18 carbons), especially fatty acid with 15 and 16 carbons are the highest. P450 BM-3 encoding gene (CYP102) has been cloned and expressed in E. coli, the purified P450 expressed from E. coli has the same function, immunochemistry and electrophoresis characteristic with the purified P450 BM-3 from B. megateriumm, and their N-terminal sequences are also consistent. The study usesd the cytochrome P450 BM-3 gene from B. megateriummALA2 for protein engineering design, according to which we conducted site-directed mutagenesis and recombination expression,and compared with the original gene expression in E. coli. F87L shows a litter higher activity towards indole than wild-type P450 BM-3, and the enzyme activity has increased by 6.98%, which proved that Phe87, playing a key role in the control of reaction selectivity, is the major factor influencing the enzyme expression and activity. The study also lay a good foundation to further exploration of cytochrome P450 BM-3 mutant for biocatalysis application. Keywords: Bacillus. Megaterium,P450 BM-3,F87L,indole II 目 录 摘 要 .............................................................................................................................................. I Abstract............................................................................................................................................II 前 言 ............................................................................................................................................. 1 1 文献综述 ..................................................................................................................................... 2 450 .................................................................................................................. 2 1.1 细胞色素P 1.1.1 细胞色素P450的酶系组成 ................................................................................... 2 1.1.2 细胞色素P450的结构折叠 ................................................................................... 2 1.1.3 细胞色素P450的底物结合与识别 ....................................................................... 3 1.1.4 细胞色素P450的天然底物 ................................................................................... 3 450的催化反应 ................................................................................... 4 1.1.5 细胞色素P 1.1.6 细胞色素P450基因的简化结构 ........................................................................... 5 1.2 细胞色素P450 BM-3 ....................................................................................................... 6 1.2.1 细胞色素P450 BM-3的来源 ................................................................................ 6 1.2.2 细胞色素P450 BM-3的结构 ................................................................................ 6 1.2.3 细胞色素P450 BM-3的表达与诱导 .................................................................... 7 1.2.4 细胞色素P450 BM-3的催化反应 ........................................................................ 7 1.2.5 细胞色素P450 BM-3的基因重组研究与应用 .................................................... 7 2 细胞色素P450 BM-3基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 .................................................. 10 2.1 实验材料 ......................................................................................................................... 10 2.1.1 主要仪器 ............................................................................................................... 10 2.1.2 菌株与质粒 ............................................................................................................11 2.1.3 培养基与储液 ........................................................................................................11 2.1.4 主要试剂 ............................................................................................................... 13 2.2 实验方法 ......................................................................................................................... 14 2.2.1 突变位点的选择 ................................................................................................... 14 2.2.2 引物设计 ............................................................................................................... 14 2.2.3 反向PCR反应...................................................................................................... 15 2.2.4 PCR产物纯化........................................................................................................ 16 i 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 ................................................................................................... 17 2.2.6 目的片段和载体割胶回收纯化 ........................................................................... 17 2.2.7 DNA浓缩 .............................................................................................................. 18 2.2.8 DNA磷酸化 .......................................................................................................... 18 2.2.9 质粒的自身环化 ................................................................................................... 19 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 ............................................................................. 19 2.2.11 重组质粒电击转化 ............................................................................................. 20 2.2.12 质粒提取 ............................................................................................................. 21 2.2.13 重组细胞色素P450 BM-3酶活检测 ................................................................ 21 450 BM-3酶活测定 ........................................................................ 22 2.2.14 细胞色素P 2.2.15 纯度鉴定方法 ..................................................................................................... 22 3 实验结果与讨论 ....................................................................................................................... 25 3.1 定点突变重组子的构建 ................................................................................................. 25 3.2 突变基因测序结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ............................................................................................. 25 ................................................................................. 26 3.3 重组质粒验证 ................................ 3.4 粗酶液SDS-PAGE分析 ................................................................................................ 26 ............................................................................. 27 3.5 酶活的初步测定 ................................ 3.6 氨基酸突变结果讨论 ..................................................................................................... 29 结 论 ........................................................................................................................................... 30 展 望 ........................................................................................................... 错误～未定义书签。 致 谢 ........................................................................................................................................... 31 参考文献 ....................................................................................................................................... 31 ii 前 言 20世纪70年代中期从巨大芽孢杆菌(B. megaterium)中发现了具有脂肪酸羟基化活性的P450，已从芽孢杆菌中将P450 BM-3纯化到同质，可作用于烷烃、脂肪酸、萜类、甾族化合物的惰性碳氢键，发生具有较高的区域选择性和立体选择性单加氧反应。因此，细胞色素P450被认为是精细化工合成的潜在催化剂。然而，它们本质上不是很活跃，表现出较差的稳定性，需要如铁氧化还原蛋白，黄素单核苷酸还原酶和NAD(P)H作为电子转移的相关因子。 细菌细胞色素P450相对比较稳定，具有高活性，并且运用重组表达系统往往可以大量准备。来源于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450 BM-3是一种经研究最好的细菌的P450，P450 BM-3分子质量很大，119 kDa，仅需底物和NADPH就有全活性。1 mol纯化的P450 BM-3包含1 mol FAD、FMN和血红素，可以催化细胞色素C以及其他人工电子受体。相比于其他P450s其性能更接近应用需求。 但很多的研究表明，该酶有十分明确的底物特异性。为了获得对除了以长链不饱和脂肪酸为底物的反应活性，细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程被广泛地研究。目前定向进化技术在改变酶功能特性和构建具有新的功能特性的酶中显示出巨大的潜力，比如P450 BM-3(A74G,F87V,L188Q)突变体能够催化吲哚生成靛蓝，这是野生型P450 BM-3所不具有的催化功能。 大肠杆菌(E.coli)具有?表达水平高，?繁殖周期短，?容易操作，?有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供使用等优点，因此常用于P450的表达。 本研究运用定点突变手段对细胞色素P450 BM-3进行改造，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比，找出影响该酶表达量和表达活力的主要因素，为进一步探索细胞色素P450 BM-3进行体外生物催化应用打下较好的基础。本研究在药物开发，生物降解和生物催化过程具有十分重要的意义，加氧酶的应用也具有广泛的市场前景。 1 1 文献综述 1.1 细胞色素P450 细胞色素P450，是一类与重金属结合的配体，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化 [1]而进行电子传递。因它与一氧化碳结合后，在450 nm处有吸收峰，故有此名。细胞色素P450广泛分布在脊椎动物或无脊椎动物(包括昆虫)、植物和微生物中。在生命过程中，内源物质的代谢与转化或外源化合物的活化与降解等都需要细胞色素P450酶系的催化与调控。由于该酶系的性质和功能及其在生命活动中它的作用，因此在药理学和毒理学的研究中它一直是引人关注的重要研究领域。 1.1.1 细胞色素P450的酶系组成 细胞色素P450是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系，作为功能单位，该酶系由多种组分组分组成。目前已知的细胞色素P450酶系的主要组分包括两种细胞色素(细胞色素P450和细胞色素b)、两种黄素蛋白(即NADPH-细胞色素5 P450还原酶和NADH-细胞色素b还原酶)以及磷脂等，其中细胞色素P450和细胞色素5 P450还原酶最为重要。 1.1.2 细胞色素P450的结构折叠 通常P450有4个β-折叠，大约是13个α-螺旋，其中β5是可变的。P450保守的结构核心由螺旋束D、E、I、L及螺旋J、K组成。螺旋I包含高度保守的苏氨酸。N-端有酸性残基，位于活性中心吡咯环B的上方。螺旋K含完全保守的E-X-X-R，可能参与稳定核心结构，位于血红素近侧(即假定的氧化还原个搭档结合侧)。螺旋L构成血红素结合区的一个部分。有两套结构保守的β-折叠，一为β-折叠1，包含5个股(strands);另一为β- [1]折叠2，包括两个股;这些折叠有助于形成疏水性的底物进入通道。 所有P450具有结构保守的共有序列(consensus sequence)，位于血红素的近表面包含完全保守的半胱氨酸(Cys)，它是血红素铁的第五个配体，也是CO-结合蛋白在450 nm有特征Soret吸收的原因。 在蛋白质的近表面还有一卷曲成为曲(meander)，其结构高度保守，以前称为芳香区(aromatic region)。 2 因此，变异较大的结构元件是螺旋A、B、B'、F、G、H、K'、β-折叠3和4以及环(loop)。这些可变区包含与底物特异性有关的部分。 图1.1 细胞色素P450的结构图 Figure1.1 The structure of P450 1.1.3 细胞色素P450的底物结合与识别 以上提到的非保守区或可变区通常与底物结合部位和氧化还原搭配(Peterson)结合部位相连。比较CYP2家族和P450 cam的序列，Gohoh(1992)鉴定出参与底物识别的区域，以底物识别部位(substrate recognition sites，SRS)加数字命名。与底物结合相连的可变区是螺旋A、B、B'、F和G以及他们毗邻的环。环B-B'和B'-C形成活性中心1(SRS-1)，螺旋F和G及它们的环形成活性中心的“进入通道”和顶(ceiling)(SRS-2和SRS-3)。β-折叠4末端的β转角(β-turn)深入活性中心(SRS-6)，β-股(1-4)的N-末端区(SRS-5)也伸入活性中心。另一个与底物结合相连、在反应机制中重要区域是保守的、螺旋I的中心部分(SRS-4)。以上区域的大多数实际在P450酶的血红素/活性中心，参与底物在囊中 [1]的定向。螺旋A、F-G环和β-股1-1和1-2似乎参与底物识别。 1.1.4 细胞色素P450的天然底物 细胞色素P450具有很广的底物谱(表1.1)既包括许多外源物质如抗体、植物次生性物质及合成有机化合物，也包括多种甾醇和其他生理过程产生的脂类。人类制造的环境化 [3]合物大多数是P450的可能底物，还有许多可作为P450 同工酶的诱导剂和抑制剂。 3 表1.1 细胞色素P450的底物 of cytochrome P450 BM-3 Table1.1 The substrates 外来物 生理过程相关 药物(含抗生素) 甾醇 致癌物 类花生四烯酸 抗氧化剂 脂肪酸 添味剂 丙酮，丙酮醇 溶剂 脂过氧化氢 农药 类视黄酸 染料 麻醉剂 石油产品 醇类 1.1.5 细胞色素P450的催化反应 细胞色素P450与底物的总反应可以用下式表示: 2e , 2HOHOROHRH22P450 RH代表底物，在催化反应过程中分子氧(O)裂解形成水和羟基化的代谢产物(ROH)。2 反应中需要两个电子和两个质子。在线粒体和许多细菌中，电子是从NADH或NADPH通过依赖FAD的还原酶来传递到铁-硫铁氧还蛋白。然而，在微粒体内质网系统中，NADPH传递电子是通过含黄素蛋白的FAD和FMN，即细胞色素P450氧化还原酶，无需FeS氧22还蛋白的中介作用，而b也可能是提供第二个电子的来源。有关各种P450系统的电子传5 递途径(Takemori et al.,1993)(图1.3)，(1)中还原的吡啶核苷酸首先还原含FAD的铁氧还蛋白还原酶，再将电子传递到铁氧还蛋白。铁氧还蛋白为还原酶和P450之间的电子穿梭(shuttle)转移。(2)中NADPH-P450还原酶含FAD和FMN作为辅基，其中FAD为从 [1]NADPH来源的电子受体，FMN为还原的FAD和P450电子转移的中间体。 4 图1.2 (1)为线粒体的电子转移系统。(2)为微粒体的电子转移系统。 Figure1.2 (1)The electron transfer system of mitochondria.(2)The electron transfer system of microsome. 细胞色素P450酶(CYPs)是一类含血红素的单加氧酶，它几乎存在于所有的生命有机体中。在NADPH或NADH 的辅助下，细胞色素P450酶可以催化一些疏水化合物的单氧化甚至还可以在非活性的C-H键引入氧原子，如作用于烷烃、脂肪酸、萜类、甾族化合物的惰性碳氢键产生具有较高区域选择性和立体选择性的单加氧反应。其催化反应的范围很广，因此CYPs是一类具有很强应用前景的生物催化剂。 细胞色素P450酶系的循环催化反应(图1.4)(Porter et al.,1991)。其中Fe表示活性部位中血红素的铁原子，RH代表底物，RH(H)代表还原产物，ROH为单氧化作用产物，XOOH2 [1]代表过氧化物作为交替的氧供体。 图1.3 P450作用机制 Figure1.3 The mechanism of P450 1.1.6 细胞色素P450基因的简化结构 细胞色素P450基因的简化结构(图1.4): 5 图1.4 P450基因的简化结构 Figure1.4 The simple structure of P450 gene 1.2 细胞色素P450 BM-3 20世纪70年代中期从巨大芽孢杆菌(B. megaterium)中发现了具有脂肪酸羟基化活性的P450，已从芽孢杆菌中将P450 BM-3纯化到同质，它能对链长大约C12~C18饱和脂肪酸及相似链长的单不饱和脂肪酸、脂肪族醇和脂肪酰胺发生羟基化或环氧化反应。 1.2.1 细胞色素P450 BM-3的来源 目前已从巨大芽孢杆菌(B. megaterium)ATCC14581中检测出2个P450活性。P450 BM-1和P450 BM-2可被巴比妥(barbiturate)诱导，P450 BM-1的Barbie盒位于5'侧翼区。P450 BM-1是含410氨基酸，分子质量为48 kDa的蛋白，与P450cam最相似。P450 BM-2是48 kDa脂肪酸羟化酶。P450 BM-1，BM-2，BM-3在B. megaterium 12个ATCC株的11个都存在，但在ATCC13368中未检测出，该菌株包括一个类型1的P450(P450meg)，它可以 [1] 在15β位置羟基化不同的甾醇。 1.2.2 细胞色素P450 BM-3的结构 P450 BM-3分子质量很大，119 kDa，仅需底物和NADPH就有全活性。1 mol纯化的P450 BM-3包含1 mol FAD、FMN和血红素，可以催化细胞色素C以及其他人工电子受体[1]。水解酶部分水解P450 BM-3得到两个结构域，其中66 kDa多肽包含两分子黄素，保持还原酶活性;另一结构域为55 kDa的血红素结构域，可与底物结合，也可与CO结合，在450 nm有吸收峰。P450 BM-3被认为是两个结构域的融合蛋白，这两个结构域分别对应于真核生物微粒体P450酶系的组成成分即P450和NADPH P450还原酶。 6 图1.5 细胞色素P450 BM-3的催化域入口 Figure1.5 The catalytic domain entrance of cytochrome P450 BM-3 1.2.3 细胞色素P450 BM-3的表达与诱导 [4]编码P450 BM-3的基因CYP102已被克隆并在大肠杆菌中得到表达，从大肠杆菌中表达的P450经纯化后与从巨大芽孢杆菌(B. megaterium)纯化的P450 BM-3有相同的功能、免疫化学和电泳特征，其N-末端序列也一致。P450 BM-3可被IPTG诱导，在培养基中加入0.5~1.0 mM的IPTG便可以诱导P450 BM-3的表达。巴比妥、芳基脲和酰胺也是P450 BM-3的诱导剂。 1.2.4 细胞色素P450 BM-3的催化反应 细胞色素P450 BM-3有十分明确的底物特异性，它快速催化链长大约C12~C18的饱和 [5,6]脂肪酸的单加氧酶活性其中对C15和C16脂肪酸的活性最高。其他底物包括相似链长的单不饱和脂肪酸、脂肪族醇和脂肪酰胺，脂肪酸酯不是P450 BM-3的底物。脂肪酸底物的羟基化作用一般在ω-2位置，也可发生在ω-1和ω-3。棕榈酸羟基化产物可以进一步作 [4,15]氧化作用的底物而进一步羟基化。不饱和脂肪酸的双键也可被环氧化。 1.2.5 细胞色素P450 BM-3的基因重组研究与应用 应用有关P450活性位点的研究成就，有可能重新设计P450的活性部位以结合和催化 7 P450的非天然底物。P450底物结合囊的细微改变，可以改变P450的底物特异性和催化效率，通过修饰P450酶可以用于选择性氧化非活性碳氢化合物。 1.2.5.1 改变底物特异性和催化效率 目前已有研究表明，通过蛋白质设计或定向进化技术，可以将P450 BM-3酶转变成另一种酶，这种酶可以催化一类在结构上与它的天然底物基本无相似的化合物。不仅可以提高其对于酚类化合物的催化活性(如2,6-二氯酚)，而且还可以提高其区域选择性，从而催 [10]化只产生一种产物。综合利用蛋白质设计和定向进化技术得到的另一种三重突变体，其 -1催化β-紫罗酮的活性大约是野生型酶的80倍，该酶的转换数可达到260 min，而且主要是产生(R)-4羟基-β紫罗酮(其对映体过量率为40%)，这种产物可以作为一种食用香料。 1.2.5.2 改变反应产物形成 在P450 BM-3位于“进入通道”入口处的β-股1-1和1-2的β-转角上的精氨酸47(R47)突变研究发现，该位点如为酸性残基则完全抑制与花生四烯酸的结合，而如突变为丙氨酸， [1]则降低底物结合达五倍。R47突变可使产物的形成也发生变化，野生型P450 BM-3产生80%的18-羟基二十碳三烯酸(18-HETE)，R47A突变体只有66%HETE，而14,15-环氧二十碳三烯酸(14,15-EET)则由野生的20%变为R47A突变体的30%。但如在活性中心发生F87V突变(B'-C环)，14,15-EET的产量由野生型的20%变为突变体的100%。Oliver等发现精氨酸47突变为谷氨酸可以产生烷基三甲基铵(alkyltrimethylammonium)羟化活性。 1.2.5.3 增强区域选择性和催化活性 Arnold和他的同事综合利用定向进化、蛋白质模型和定点突变的方法来改变P450 BM-3酶的特性，得到一系列的突变体，分别用于催化十二烷烃、辛烷、己烷、丙烷和乙烷的羟基化。P450 BM-3酶其中的一种突变体具有一个最佳的还原酶区域，它可以直接将乙烷氧化成乙醇，但催化效率比较低，耦合效率也小于1%。 鉴于P450 BM-3酶和其突变体的广泛用途，许多研究者尝试着将其催化的反应放大。比如用P450 BM-3酶催化亚麻酸来工业化生产15(R),16(S),9,12-环氧十八二烯酸(对映体 [11]过量率60%)，在优化的反应条件下，这种酶表现出很高的区域选择性和催化活性。 8 图1.6 细胞色素P450 BM-3选择性环氧化亚麻酸 Figure1.6 Cytochrome P450 BM-3 shows selective epoxidation towards linolenic acid 1.2.5.4 增强酶的稳定性和催化效率以及耦合效率 +通过研究P450 BM-3酶在水-环己烷双相系统中的作用效应，该系统是利用NADP依赖型甲酸脱氢酶来提供回收辅因子。结果发现，假如加入稳定因子，如牛血清白蛋白和过 [13]氧化氢酶，P450 BM-3酶可保持活性长达100 h，而且催化产物只有环己醇。在该双相系统中，P450 BM-3酶突变体则表现出更高的稳定性和催化效率，在依赖NADPH的环己烷羟基化反应中，该突变体酶有很高的催化活性。利用定点突变的方法使得P450 BM-3的还原酶区接受NADPH，这样的突变体也有上述的特性。研究证明，NADPH依赖型的单加氧酶突变体在合适的条件下可以表现出很高的稳定性和催化效率以及高耦合效率(有的高达60%)。 9 2 细胞色素P450 BM-3基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 2.1 实验材料 2.1.1 主要仪器 表2.1 主要仪器及来源 Main instruments and manufacturer Table2.1 仪 器 名 称 型 号生 产 厂 家 梯度PCR仪 MasterCycler Gradient 5331 德国Eppendorf Bio-photometer 6131 德国Eppendorf 核酸电泳仪 DYY2-C 北京六一 蛋白电泳仪 VE-180 上海天能 凝胶成像系统 Quantity One 170 -8171 美国Bio-Rad -86 ?超低温冰箱 U410-86 英国New Brunswick Scientific 旋涡振荡器 Vortex Genie 2 美国Scientific Industries 电子天平 AY120 日本岛津 自动蒸汽灭菌锅 D-1 AUTO CLAVE 北京发思科贸 超净工作台 VS-1300L-U 苏州安泰 生化培养箱 SP-300B 南京恒裕 恒温培养振荡器 ZHWY-2102C 上海智城 高速冷冻离心机 X-22R 美国BECKMAN 水浴振荡器 THZ-82 常州国华企业 电热鼓风干燥箱 PHG-9123A 上海精宏 冰箱 BCD-518WS 海尔集团 10 2.1.2 菌株与质粒 宿主菌为E. coli TOP10。 质粒载体为pTrc99A，原始重组质粒由本 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 构建。 2.1.3 培养基与储液 (1)LB 培养基(1000 mL): 液体培养基:胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。 固体培养基:胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g。 搅拌使之完全溶解，用NaOH 调pH 至7.0，高压灭菌20 min(121? 0.1 Mpa) (2)SOB 培养基(1000 mL): 20 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，0.5 g NaCl，加入约800 mL的去离子水，溶解后加入10 mL 250 mmol/L KCl溶液(将1.86 g KCl 用100 mL 去离子水溶解即配成250 mmol/L KCl 溶 2液)，用5 mol/L NaOH调节pH值至7.0(约0.2 mL)，定容至1 L。在15 psi(1.05 kg/cm)高温高压灭菌20 min，4 ?保存。使用前加入5 mL灭菌的2 mol/L MgCl溶液(用90 mL 去离2 子水溶解19 g MgCl，用去离子水溶解19 gMgCl，用去离子水调整体积为100 mL，在15 psi22 (1.05 kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20 min)。 (3)SOC培养基 向100 mL SOB培养基中加入2 mL过滤除菌的1 mol/L 葡萄糖溶液混合均匀，4?保存。 (4)氨苄青霉素储存液 用无菌双蒸水配成100 mg/mL，过滤除菌，分装于-20?保存。 (5)10×TBE琼脂糖凝胶电泳缓冲液 称取Tris 108 g，NaEDTA?2HO 7.44 g，硼酸55 g，加蒸馏水定至1 L，室温保存，使22 用时稀释10倍。 (6)碱裂解质粒小提试剂 (a)Solution? 分别取25 mL 1 mol/L Tris?HCl(pH 8.0)，20 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)，45 mL 20% glucose(W/V)，加ddHO定容至1 L。121 ?灭菌20 min，4?保存。使用前每50 mL的2 Solution?中加入2 mL的RNase A(20 mg/mL)。 (b)Solution? 11 分别取50 mL 2 mol/L NaOH，50 mL 10% SDS(W/V)，加灭菌水定容至500 mL。室温保存。此溶液保存时间不要超过一个月。同时，SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 (c)Solution? 称取147 g KOAc，加入300 mL去离子水后搅拌溶解，加入57.5 mL CHCOOH，用去离3子水定容至500 mL。121?灭菌20 min，4 ?保存。 (7)SDS-PAGE蛋白电泳试剂 (a)30%丙烯酰胺凝胶贮备液 称取29.2 g丙烯酰胺，0.8 g甲叉双丙烯酰胺，加水至100 mL，通风橱操作，过滤后棕色瓶避光保存。 (b)1.5 mol/L Tris?HCl分离胶缓冲液(pH 8.8) 称取18.15 g Tris，用l mol/L HCl调pH值至8.8，加水至100 mL，4?保存。 (c)0.5 mol/L Tris?HCl浓缩胶缓冲液(pH6.8) 称取6 g Tris，用l mol/L HCl调pH值至6.8，加水至100 mL，4?保存。 (d)10% SDS溶液 称取10 g SDS，加水至100 mL，完全溶解后室温保存。 (e)50%GY 量取50 mL甘油，加水定至100 mL，室温保存。 (f)1%溴酚蓝 称取100 mg溴酚蓝，加水定至10 mL，过滤后4?保存。 (g)10%过硫酸铵 称取1 g过硫酸铵，溶于10 mL水中，贮于4?，使用不可超过2周。 (h)5×Loading Buffer 取1.2 mL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)，2.5 mL甘油，1 g SDS，50 mg溴酚蓝，加去离子水定至10 mL，分装成小份(500 μL/管)，贮于室温。用前每小份中加入25 μL的β-巯基乙醇，加入β-巯基乙醇之后可在室温保存1个月。 (i)电泳缓冲液(pH8.3) 称取3 g Tris，18.8 g甘氨酸，1 g SDS，定容至1 L，室温保存。 (j)染色液 称取1 g考马斯亮蓝R-250于1 L烧杯中，加入250 mL异丙醇搅拌溶解，再加入100 mL冰乙酸和650 mL水，混匀，过滤后室温贮存。 (k)脱色液 12 量取100 mL冰乙酸，50 mL乙醇，850 mL水，混匀后室温贮存。 2.1.4 主要试剂 表2.2 主要试剂及来源 Main reagents and manufacturer Table2.2 生产厂家 试剂 DNA 聚合酶 TAKARA T4 DNA 连接酶 TAKARA 电泳级琼脂糖 OXOID BIOMIGA 琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒 质粒小提试剂盒 BIOMIGA 氨苄青霉素 南京天为时代 过硫酸铵 SCIGENE 酵母提取物 OXOID 胰蛋白胨 OXOID 葡萄糖 国药集团上海化学试剂公司 琼脂粉 南京基天生物技术有限公司 ANGUS 三羟甲基胺基甲烷(Tris) EDTA 国药集团上海化学试剂公司 NaCl 南京化学试剂有限公司 NaOH 南京化学试剂有限公司 MgCl 南京化学试剂有限公司 2 HCl 南京化学试剂有限公司 13 2.2 实验方法 2.2.1 突变位点的选择 爱丁堡大学化学系，细胞及分子生物学研究所和斯特拉斯克莱德大学理论及应用化学 [14]系的Tobias等探索了对P450的底物结合部位进行理性设计的可能性。他们所使用的模型为结合了棕榈酸的P450 BM-3酶。为我进行定点突变提供了结构指导。如图2.1所示，P450 BM-3肽链中第87位的苯丙氨酸残基，位于活性中心且高度保守，侧链上的苯环可以改变活性区域(疏水通道)的构象，并且指导脂肪酸的取向。突变此点可以改变P450 BM-3的底物选择性和立体区域选择性。 图2.1 细胞色素P450 BM-3和底物棕榈酸对接 Figure2.1 The modeling of cytochrome P450 BM-3 and substrate docking 2.2.2 引物设计 本实验通过DNA序列测定确定了突变位点碱基序列的变化，以及碱基对应氨基酸的变化。由于易错PCR方法的不可预见性，决定采用定点突变的方法，通过反向PCR对细胞色素P450 BM-3进行定向改造。通过在设计引物时人为改变碱基序列实现细胞色素P450 BM-3的定向进化，本实验因时间有限，只将细胞色素P450 BM-3活性中心87位残基上的苯丙氨酸进行定向改造。 14 图2.2 一步反向PCR法致点突变原理示意图 ne-step opposite direction PCR method Figure2.2 Schematic diagram of o 引物设计如下: F87突变的引物序列: 上游引物5'-GTCCAGCTTGTNNNTAAACCGTCTCC-3' 下游引物5'-GCCGAAAAAAAACTGGAAAAAAGCGC-3' 加粗体下划线的碱基表示人为引入突变位点。设计好的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 2.2.3 反向PCR反应 以设计的质粒为模板，PCR反应体系的组成: 表2.3 PCR反应体系 Table2.3 PCR reaction system 成分 加量(µL) ddHO 32.5 2 TM5×PrimeSTARBuffer 10.0 dNTP 10 mmol/L 4.0 15 P1 10 µmol/L 1.0 P2 10 µmol/L 1.0 1.0 Templates TM PrimeSTARHS DNA Polymerase(2.5 U/µL) 0.5 Total 50.0 按下列程序进行PCR循环扩增: 表2.4 PCR反应程序 Table2.4 PCR reaction program 步骤 温度(?)时间(min) Stage1 955 1 95 1 Stage2(32cycles) 52.6 7.5 72 Stage3 15 72 直接进行下一步实验或将PCR扩增产物置4?保存。 2.2.4 PCR产物纯化 为降低产物浓度，采用BIOMIGA的PCR产物纯化试剂盒进行纯化。具体步骤为: (1)收集4?保存的PCR反应液。 µL的PCR反应液，加入100 µL Buffer GC)， (2)加入2倍体积的Buffer GC(如50 混合均匀。 µL (3)将上述混合液(每次不超过700 )移至一个带有收集管的吸附柱中，室温下13,000 rpm室温离心1 min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液，将吸附柱放回到收集管中。重复步骤(3)，直到剩余的混合液全部通过吸附柱。 µL (4)加入650 DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复步骤(4)一次。 (5)室温下，13,000 rpm，将吸附柱开盖离心2 min，去除残留的乙醇。 16 (6)将吸附柱放入干净的1.5 mL离心管中，在吸附柱膜中央加入30,50 μL Elution Buffer或ddHO，室温放置1 min。13,000 rpm离心1 min，离心管中的液体即为包含目的2 DNA片段的溶液，取2,5 μL进行电泳检测浓度，纯化好的DNA可立即用于后续实验或于-20?冻存。 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 (l)琼脂糖凝胶的制备 称取0.2 g琼脂糖，置于三角瓶中，加入20 mL 1×TBE缓冲液(胶浓度1 %)，电炉加热至琼脂糖完全溶解，冷至60?左右时，加入核酸染料至终浓度为0.5 μg/mL，摇匀后倒入事先插好梳子的制胶槽中，轻微晃动使胶液面平整，室温放置约40 min使胶完全凝固，然后小心拔去梳子，将胶放入盛有1×TBE缓冲液的电泳槽中。缓冲液应没过胶面约5 mm，且加样孔靠近电泳槽负极。 (2)加样 将5 μL DNA样品与1 μL 6×Loading Buffer混匀，小心加入加样孔中，同时加入DL 10， 000或1kb ladder Marker。 (3)电泳 接对电泳槽正负电源线，打开电泳仪电源，设定100~120 V恒压电泳，待溴酚蓝前沿跑至距凝胶正极端约1 cm左右时停止电泳。 (4)成像 将胶置于凝胶成像系统(BIO-RAD)中，紫外光下拍摄图像，并进行条带分析。 2.2.6 目的片段和载体割胶回收纯化 用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外照射下，切下目标DNA。从琼脂糖凝胶中回收DNA采用BIOMIGA的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收DNA。 (1)在紫外灯下用干净锋利的手术刀片切下含有目的条带的凝胶块，放入1.5 mL离心管中，计算凝胶块的重量。 (2)每100 mg琼脂糖凝胶加入不少于100 μL Buffer GC，于50,60?温浴10 min，每2,3 min间断混合，直至凝胶完全融化。 (3)将上述混合液移至一个带有收集管的吸附柱中，室温下13,000 rpm室温离心1 min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液，将吸附柱放回到收集管中。重复步骤(3)，直 17 到剩余的混合液全部通过吸附柱。 (4)加入650 μL DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复步骤(4)一次。 (5)室温下，13,000 rpm，将吸附柱开盖离心2 min，去除残余的乙醇。 (6)将吸附柱放入干净的1.5 mL离心管中，在吸附柱膜中央加入30,50 μL Elution Buffer或ddHO，室温放置1 min。13,000 rpm离心1 min，离心管中的液体即为包含目的2 DNA片段的溶液，取2,5 μL进行电泳检测浓度，纯化好的DNA可立即用于后续实验或于-20?冻存。 2.2.7 DNA浓缩 将纯化过后的PCR中加入0.1倍体积的3 mol/L 的乙酸钠(pH 5.2)，再加入总体积3倍量的无水乙醇，混匀，-80?放置1 h后，4?，13,000 rpm 离心40 min，轻柔弃上清。再加入600 µL 75%乙醇(现配)，轻柔混匀，室温10 min，4?，13,000 rpm 离心15 min， ddHO反复轻柔吹打重悬。 彻底弃上清，超净工作台小风风干。然后加入8 µL 2 2.2.8 DNA磷酸化 DNA浓缩后按表2.5进行磷酸化反应: 表2.5 DNA磷酸化反应体系 Table2.5 DNA phosphorylation reaction system 成分 加量(µL) 浓缩过后的 PCR 纯化产物8.0 1.0 T4 Ligase 10× buffer T4 Polynucleotide Kinase(10 U/µL) 1.0 Total 10.0 37?水浴3 h后，加热至70?，5 min使T4磷酸化激酶失活。 18 2.2.9 质粒的自身环化 磷酸化后的DNA按表2.6进行质粒的自身环化反应: 表2.6 质粒的自身环化反应体系 Table2.6 Plasmid cyclization reaction system 成分 加量(µL) 磷酸化质粒8.0 1.0 T4 Ligase 10× buffer T4 DNA Ligase(5 U/µL) 1.0 Total 10.0 将上述体系置 16?下水浴过夜。之后取1.0 ~ 2.0 µL用于电转化。 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)-80?冰箱中取出保存的大肠杆菌E. coli Top 10。在LB平板上划线，37?过夜培养至长出单菌落。 (2)长出单菌落后，马上挑取一个接种到5 mL LB液体培养基，37?温和震荡培养5过夜。 (3)将2 mL培养物加入到盛有200 mL LB液体培养基的1000 mL烧瓶中，37?，180 rpm，摇床培养至OD为0.3~0.4为宜。 600 (4)菌液冰浴冷却10~15 min，在超净工作台中，将OD值适宜的培养液分装到6支已预冷的50 mL离心管中，对称放入离心机中，4?，5000 g离心15 min。 (5)动作温柔、弃去上清，用已预冷的去离子水(盖满离心管底部为宜)，混匀，手工震荡重悬。 (6)重悬完成后，用预冷的去离子水定容至离心管体积的2/3左右，4?，5000 g离心10min，弃上清液。 (7)重复步骤(5)，(6)。 (8)加入盖满离心管底部的10%(v/v)甘油，重悬，用预冷的10%(v/v)甘油定容至离心管体积的2/3左右，4?，5000 g离心10 min，弃上清液。 19 (9)重复步骤(8)。 (10)加入盖满离心管底部1/2体积10%(v/v)甘油，重悬，合管后用预冷10%(v/v)甘油定容至离心管体积的2/3。再用另一个同样大小的离心管加入同等体积水作为平衡管，4?，5000 g离心10 min。 µL， (11)制备30管，每管55 加入1.7 mL已预冷的10%(v/v)甘油，重悬菌体，分装于预冷的离心管中，贮存于-80?冰箱中。 2.2.11 重组质粒电击转化 质粒重组后按表2.7进行电转化反应: 表2.7 电转化体系 Table2.7 Electroporation system 成分 加量(µL) 质粒或重组质粒2.0 大肠杆菌感受态细胞TOP10 55.0 SOC(37? 预热) 1000.0 电击转化具体操作如下: (1)将含有55 μL 感受态细胞1.5 mL菌离心管与电击仪样品池一起放在冰上冷却。 (2)取连接过夜的产物1.0 ~ 2.0 μL，至于冰上30,60 s后与感受态细胞混合均匀。 (3)调节电击仪，使电脉冲为25 μF，电压2.5 KV，电阻200 Ω。 (4)将细菌与质粒混合液加至冷的电击池中，轻击液体以确保细菌与质粒悬液位于电击池底部。擦干电击槽外的冷凝水与雾气。将电击池插入电击仪。 (5)按上述设定的参数，启动电击仪。 (6)电击结束后，尽可能快的取出样品池，室温下加入1 mL SOC 培养液，混匀。 (7)将细胞转移至1.5 mL 预冷的灭菌离心管，于37? 180 rpm摇床培养45~60 min。 (8)10,000 rpm离心，吸取800 μL 上清液，弃去。重悬，全部(约200 μL)转移到含有Amp的LB平板上，涂布，风干。 (9)倒置平板于37?培养，转化克隆应在12~16 h内出现。 20 2.2.12 质粒提取 质粒提取采用BIOMIGA质粒提取试剂盒进行。具体过程如下: (1)接种新鲜的单个菌落到5 mL的LB培养基(含适量抗生素)，37?震荡培养14~16小时。室温下13,000 rpm离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。 (2)加入250 μL Buffer A1(确保已加入RNase A)，用移液枪或涡流震荡充分悬浮细菌细胞。 (3)加入250 μL Buffer B1，轻轻地反转10次以混合均匀，然后静置5分钟至溶液粘稠而澄清。 (4)加入350 μL Buffer N1，立即反转多次至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。 (5)将离心管转至高速离心机，在室温下13,000 rpm离心十分钟(若上清中有白色沉淀，可再次离心)。 (6)小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中(避免吸起沉淀)，室温下13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。 (7)向DNA柱中加入500 μL Buffer KB，室温下13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。 (8)向离心柱中加入500 μL DNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇)，室温下，13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤(8)。 (9)将离心柱放回高速离心机中，13,000 rpm室温下开盖离心5~10分钟，以彻底去除残留的乙醇。 (10)将离心柱转至一个新的1.5 mL离心管中，向DNA柱的正中间加入50~100 μL的ddHO(pH在7.0~8.5之间)或Elution Buffer，室温放置2分钟，13,000 rpm离心1分2 钟，收集洗脱液。 离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液，取2,5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20?冻存。 2.2.13 重组细胞色素P450 BM-3酶活检测 转化至感受态细胞中的目的基因含有强启动子和终止子，当加入诱导剂时，目的基因上高效转录合成大量的mRNA，然后翻译合成蛋白质，即可测其活力。具体步骤如下: (1)重组菌的培养及诱导表达 21 挑取转化子单菌落于250 mL三角瓶中(按1%接种量接种于50 mL加氨苄青霉素的LB培养液，氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL)，于37?培养至OD值0.8左右时，加入IPTG至600 终浓度0.5 mmol/L，30?诱导表达12 h。 (2)粗酶液的制备 将菌液以13,000 rpm离心1 min收集菌体，加PBS缓冲液(pH 7.5)洗涤细胞2次，并用4000 μL PBS(pH 7.5)重悬细胞，超声波破碎细胞，观察到悬液由浑浊到粘稠，再到澄清，13,000 rpm，4?离心15 min去除细胞碎片沉淀，取上清备用。 2.2.14 细胞色素P450 BM-3酶活测定 [3] 由于NADPH在340 nm有最大的光吸收，随着辅酶的消耗，溶液在340 nm处吸光值下降，而且在反应最初的2-4 min内呈线性关系，因此，通过比较反应3 min时的吸光值就可以算出酶活。 mL离心管测定方法:在1.5 中加入25 μL 100 mM的吲哚溶液(溶于DMSO)，然后加入575 μL的pH 7.5 PBS，再添加5 μL 50 mM的NADPH溶液，最后加入400 μL粗酶液，混匀。室温反应2 min后，取700 μL于比色皿中，立刻测定此时340 nm处的吸光度变化，平行实验3次。 定义:将在37?下，每分钟催化反应消耗l μM NADPH所需要的酶量为1U。则可以通过下面的公式计算酶活: dA-，，，VVV，，，，NADPH底物酶液dt340nm酶活U/mL,，，P450 BM-3-36.2210，，V酶液 -1-1其中NADPH的摩尔消光系数为6.22 mol?L?cm。 2.2.15 纯度鉴定方法 [22]分离纯化产物的定性鉴定采用SDS-PAGE凝胶电泳法。 2.2.15.1 凝胶的制备 (1)用洗涤剂洗净玻璃板、梳子、电泳槽等物件，然后蒸馏水冲洗干净并晾干。将2块制胶用玻璃板叠放整齐，用夹子夹好，固定在垫条上，插梳子端朝上。 (2)确定凝胶体积，按表2.8配制分离胶。 将分离胶各组分依次混合(勿剧烈震荡)后，用移液枪沿着玻璃板迅速加入到两玻璃板的中间胶格中，小心不要产生气泡，当胶液至玻璃板上沿约4~5 cm处停止加入。再加入 22 1~2 mL无菌水做水封，加水时，注意不要扰动凝胶液面，避免产生气泡，保证凝胶能正常聚合。 表2.8 8%SDS-PAGE分离胶配方 Table2.8 8% separation gel formula 组分 体积(mL) ddHO 6.324 2 2.25 1.5 M Tris-HCl分离胶buffer(pH8.8) 10%SDS 0.12 30%丙烯酰胺 3.24 10%过硫酸铵 0.06 TEMED 0.012 Total 12 (3)室温静置约30 min后，水封层与凝胶层之间会出现明显的界线，倒去上层水，并用吸水纸尽量吸干。 (4)按表2.9配制浓缩胶。 表2.9 4%SDS-PAGE浓缩胶配方 Table2.9 4% spacer gel formula 组分 体积(mL) ddHO 3.0 2 0.5 M Tris?HCl浓缩胶buffer(pH6.8) 1.25 10 %SDS 0.05 30 %丙烯酰胺 0.67 10 %过硫酸铵 0.025 TEMED 0.005 Total 5 将浓缩胶各组分依次混合(勿剧烈震荡)后，小心加入玻璃板胶格中直至顶部。然后再小心插入梳子，避免梳孔处产生气泡。 23 (5)室温静置约30 min，至凝胶完全凝固。小心拔出梳子，用少量电泳缓冲液清洗梳孔处未聚合的胶液。 2.2.15.2 样品的制备 直接从-80?取出上清液，冰上解冻，与相应体积的5×Loading Buffer混匀，沸水中煮10 min，取出冷却，离心后取上层进样分析。 2.2.15.3 电泳检测 (1)将做好的凝胶放入电泳槽内，内外槽都加入电泳缓冲液，内槽缓冲液稍高，且没过胶面2~3 mm。 (2)用微量注射器吸取一定体积制备好的样品依次序加入到梳孔中，同时加入蛋白质Marker。 (3)接好电极，接通电源，调节电压为80 V，待溴酚蓝染料进入分离胶时，将电压调100 V直至溴酚蓝前言移至距分离胶底部约0.5~1 cm处，即可停止电泳。 为 (4)电泳结束后，关闭电源开关，拔掉电极线，倒出缓冲液，松开玻璃板夹子，取下胶室，将两块玻璃板轻轻揭开后取出凝胶，将其置于大平皿中。 (5)加入考马斯亮蓝染色液，轻微振荡下染色3 h。 (6)染色完毕后，弃去染色液，自来水冲洗掉未弃净的染色液。加入脱色液缓慢振荡脱色4~6 h，期间换脱色液2~3次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质条带清晰为止。 (7)在凝胶成像仪上拍照并分析结果。 24 3 实验结果与讨论 3.1 定点突变重组子的构建 以设计质粒(7,300 bp左右)为模板进行PCR扩增，反应体系和反应条件如实验材料与方法中所述。扩增产物经过纯化后，用l%琼脂糖凝胶电泳再次检测(如图3.1)，结果在7,300 bp左右出现预期条带，表明克隆成功。 图3.1 PCR产物核酸电泳 Figure3.1 Analysis of DNA electrophoresis of PCR products (M:DL 10,000 DNA Marker;1~2:PCR产物) 3.2 突变基因测序结果与分析 为确定经反向PCR所获得的目的片段的具体序列，先提取突变质粒，然后送交测序公司进行序列测定。将测定序列与原始基因序列对比，仅有1处碱基不同。经翻译后，第87位的苯丙氨酸突变为亮氨酸。测序结果如下: Fast alignment of DNA sequences H07-G05190480-mut-4J-PTRC99C.F and ALA2T Ktuple=2 Gap_penalty=7 Upper line: H07-G05190480-mut-4J-PTRC99C.F Lower line: ALA2 identity=78.17% gap=0.92% 25 TTGACAAGCTGGAC„„„„ „„GTTTA ||||||||||||||||||| „„GTTTATTTACAAGCTGGAC„„„„ 3.3 重组质粒验证 将3 µL重组质粒点样于1.0%的琼脂糖凝胶上的小孔中，在100 V电压下电泳约1 h，然后在紫外下照射观察或拍照验证质粒(如图3.2)。结果表明在7,300 bp左右，这与预期长度相符，表明质粒备份成功。 图3.2 重组质粒核酸电泳 Figure3.2 Analysis of DNA electrophoresis of recombinant plasmid (M:DL10,000 DNA Marker;1~2:重组质粒) 3.4 粗酶液SDS-PAGE分析 重组基因表达后，对目的蛋白进行了SDS-PAGE分析，结果如图3.2所示，图中1泳道为未突变菌所得酶液，2泳道为空白样，3~6泳道为突变菌酶液。由图可看出，突变菌酶液都在约119 kDa处有一明显条带，且基本没有其它杂带产生，可以判定119 kDa处的条带为重组细胞色素P450 BM-3蛋白的条带。3号突变样可能发生阅读框遗码，未产生突变蛋白。4号和5号同义突变蛋白。6号为F87L突变蛋白。 26 图3.3 目的蛋白产物SDS-PAGE凝胶电泳 Figure3.3 SDS-PAGE analysis of target proteins (M:蛋白质Marker，1:未突变蛋白，2:空白样，3~6突变蛋白样品) 3.5 酶活的初步测定 根据2.2.14所述测定酶活的方法，对酶进行酶活测定，相关数据如下: ori 11.10 ori 2 ori 31.05 1.00 0.95 0.90 A3400.85 0.80 0.75 0.70 150160170180190200210 Time (sec) 图3.4 Ori 消耗NADPH的反应进程曲线 Figure3.4 Time course of NADPH consumption in incubations with Ori 27 1.15 mut1 mut21.10 mut31.05 1.00 0.95 0.90340A0.85 0.80 0.75 0.70 0.65150160170180190200210 Time (sec) 图3.5 Mut消耗NADPH的反应进程曲线 Figure3.5 Time course of NADPH consumption in incubations with Mut 表3.1 酶活相关数据 Table3.0 Datas of enzyme activity OriMut 项目 (dA/dt) (dA/dt) 340nm340nm -0.0041 1-0.0044 -0.0043 -0.0047 2 -0.0044 3 -0.0044 -0.0043 Average -0.0046 1.73 Activity(U/mL) 1.85 根据上述数据，经计算: 酶活酶活-MOutri酶活提高百分数=100% = 6.98%，酶活Ori 28 3.6 氨基酸突变结果讨论 根据测序分析和酶活测定结果，我们可以看出:亮氨酸和苯丙氨酸同属于非极性氨基酸，对疏水通道的极性影响较小，不会使其丧失催化活性。与此同时，Leu的侧链(CH)CH-32与Phe的侧链(CH)CH-相比，空间位阻较小，可以增大底物的多样性，从而不只限于饱和652 脂肪酸。理论上讲，也可以用于不饱和脂肪酸等的催化。 图3.6 F87与L87空间结构比较 Figure3.6 Comparison of structures between F87 and L87 29 结 论 本文主要运用基因工程方法对P450 BM-3基因进行定向改造，以期获得酶活较高的突变株。得出如下结论: (1)反向PCR获得目的片段大小为7,300 bp，经测序分析，将测定序列与原始基因序列对比，第87位的苯丙氨酸突变为亮氨酸。 (2)经SDS-PAGE分析，显示重组基因表达后条带大小都为119 kDa，且基本无其它杂带，表明成功获得细胞色素P450 BM-3突变蛋白。 (3)突变酶最终酶活比原始酶提高了6.98%。 30 致 谢 本文是在导师 的悉心指导和严格要求下完成的。要特别感谢我的导师 老师， 对本课题的开展倾注了大量的心血，从一开始 就给了我正确的毕业论文导向，使我有了清晰的思路。在实验过程中， 多次对我进行技术上的指导，并循循善诱，培养了我的动手能力、思维的严谨性和创新性。论文的撰写、审阅等方方面面无不凝结着 的心血。在此，对 三个月来的关怀和教诲献上最诚挚的谢意～ 整个实验中得到了 ， 的热情帮助。他们在实验中给予了我极大的帮助，教会了我许多知识和实验操作方面的技巧。在此向他们表示最衷心的感谢～ 感谢同一实验室的同学们: 在实验过程中给予的极大关心与支持，同我一同走过大学四年的最后时光。 感谢父母与亲人一直以来对我的关心和呵护，他们给了我莫大的鼓励和支持。 师恩难忘，同窗情深。最后祝愿我的恩师们身体健康，祝愿 师兄师姐师弟师妹们学业有成～ 参考文献 [1] 冷欣夫，邱星辉编著. 细胞色素P450酶系的结构、功能与应用前景. 北京:科学技术出版社，2001 31 [2] [瑞士]雷蒙(Reymond,J.-L.)编著. 酶活检测——高通量筛选，遗传选择以及指纹分析. 林漳凛，蔡真 译. 北京:化学工业出版社，2008 [3] 高瞬晔. 细胞色素P450 BM-3突变体催化羟基化的研究. 浙江大学，硕士学位论文，2006 [4] Miura Y, Fulco A J. 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