鹅掌柴中总黄酮含量的测定

鹅掌柴中总黄酮含量的测定 鹅掌柴中总黄酮含量的测定 江苏农业科学2010年第4期 范树国,胡永昌,邱璐,等.鹅掌柴中总黄酮含量的测定[J].江苏农业科学,2010(4):280—282 鹅掌柴中总黄酮含量的测定 范树国,胡永昌,邱璐,李国树,李天星,杨海艳,周丽娟,陈安林 (1.楚雄师范学院化学与生命科学系,云南楚雄675000;2.滇中高原生物资源开发与利用研究所,云南楚雄675000) 摘要:采用50%稀乙醇冷浸法,70%乙醇热回流法和95%乙醇超声波提取法提取鹅掌柴中总黄酮,以芸香苷为 对照品,在A=510nm处分别测定鹅掌柴根,茎,叶中总黄酮类化合物的含量.结果表明,芸香苷在0—0.05mg,/mL范 围内峰吸光度与浓度线性关系良好(,=0.9999,=6),仪器精密度RSD=0.31%(=6).50%稀乙醇冷浸法中鹅掌 柴根,茎,叶总黄酮含量分别为3.54%,2.01%,6.11%;70%乙醇热回流法中鹅掌柴根,茎,叶总黄酮含量分别为 4.48%,3.81%,7.14%;95%乙醇超声波提取法中鹅掌柴根,茎,叶中总黄酮含量分别为4.60%,3.95%,7.26%. 关键词:鹅掌柴;总黄酮;可见分光光度法 中图分类号:S567.901文献标志码:A文章编号:1002—1302(2010)04—0280—03 鹅掌柴[Scheffleraocwphflla(I-our.)Harms],别称鸭脚 木,五加科鹅掌柴属,研究表明,鹅掌柴属植物具有抗肿瘤,抗 病毒等活性….鹅掌柴以根茎人药,性温,昧甘,具有祛风 湿,活血脉之功效.一些学者曾对鹅掌柴根提取物进行定 收稿日期:2009一l1—03 基金项目:云南省中青年学术技术带头人后备人才培养 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 (编号: 2006PY01—61);楚雄师范学院重点学科建设项目(编号: 05YJJsxK03);楚雄师范学院学术带头人专项资助项目(编号: 05YJDTR08). 作者简介:范树国(1965一),男,河北青县人,博士,教授,主要从事植 物生理生化及分子生物学研究.Tel:(0878)3101953;E—mail: fan~@cxtc.edu.cn. 通信作者:邱璐,教授,主要从事植物组织培养及转基因研究.Tel: (0878)3100507;E—mail:qiulu@cxtc.edu.en. 性检测其化学成分,发现含有挥发油,内酯,黄酮,生物碱,油 脂,皂苷,有机酸,鞣质,糖,氨基酸等.黄酮类化合物具有 降血脂,止血,抑制血小板聚集等作用.近年来,有文献报道, 天然的黄酮类化合物对蛋白激酶的活性具有抑制作用,从 而干预细胞信号转导,诱导细胞凋亡,抗肿瘤作用机制与它们 能抑制各种细胞信号转导途径中的蛋白激酶有关.一些具有 明显抗肿瘤作用的黄酮类化合物已达到临床2期研究阶 段.目前,有关鹅掌柴总黄酮含量的研究尚未见报道. 本研究分别采用50%稀乙醇冷浸法,70%乙醇热回流法和 95%乙醇超声波提取法对鹅掌柴总黄酮进行提取,采用可见 光分光光度法测定提取物的吸光度,计算鹅掌柴总黄酮的质 量分数,并比较3种方法下鹅掌柴总黄酮的提取效率,旨在为 鹅掌柴的开发利用及进一步深入研究提供指导. (上接第279页) 法具有很好的准确度. 2.4方法的稳定性试验结果 将对照品溶液及样品溶液在显色后每隔20min测定1 次吸光度,结果见表2.由表2可知,样品溶液和对照品溶液 在显色后2h内吸光度变化都不大,RSD值都较小,说明该方 法的稳定性较好. 2.5重复性试验结果 从同一竹节参多糖样品溶液中取相同体积的溶液5份, 分别测定其吸光度,分别为0.423,0.426,0.428,0.426及 0.425,RSD值为0.43%.由此可见,该方法的重复性较好. 表2稳定性试验结果 2.6竹节参多糖含量的测定结果 称取一定量的竹节参样品,3次重复,按样品溶液的制 备方法制备样品,多糖的质量分数分别为17.2%,16.8%和 16.5%,平均值为16.83%. 参考文献: [1]范崔生.中药采收鉴别应用全书[M].南昌:江西科学技术出版 社,1995:347—348. [2]肖本见,谭志鑫,朱敏英,等.竹节人参对小鼠低氧/复氧损伤的 保护作用[J].中国公共卫生,2006,22(4):473. [3]吴瑕,陈东辉,雷玲,等.竹节人参抗炎镇痛作用研究[J]. 中药药理与临床,2007,23(1):43—45. [4]肖见本,陈国栋,谭志鑫,等.竹节人参对脑缺血大鼠兴奋性氨基 酸的影响[J],中药药理与临床,2005,21(6):36—38. [5]左锐,袁丁.竹节参化学成分和药理活性研究进展[J].时 珍国医国药,2005,16(9):838—839,841. [6]刘桂林,陈平,张俊红,等.鄂产竹节参多糖成分抗疲劳作用的 研究[J].中国医院药学杂志,2006,26(12):1459—1461. 范树国等:鹅掌柴中总黄酮含量的测定 1材料与方法 1.1材料 鹅掌柴取自楚雄师范学院.标准品芸香苷购自科翔生物 有限公司(HPLC级,纯度>98%). 1.2方法 1.2.1标准品溶液的制备精确称取芸香苷标准品5mg, 70%乙醇溶解,于50mL容量瓶中定容,配制得芸香苷标准品 溶液. 1.2.2样品初处理取鹅掌柴根,茎,叶洗净,105?下烘干 至恒重,粉碎过40目. 1.2.350%稀乙醇冷浸法称取5.0g干鹅掌柴根,茎,叶 粗粉,浸泡在75mL50%乙醇中,室温下放置24h后抽滤,滤 渣再用75mL50%乙醇浸泡,室温下再放置24h后抽滤除 渣,合并2次滤液,水浴上浓缩至原体积的一半,然后用石油 醚(60,90?)脱脂2次,水液在水浴上蒸至浆液状,控制在 60?以下干燥可得提取物. 1.2.470%乙醇热回流法称取5.0g干鹅掌柴根,茎,叶 粉碎,浸泡在75mL70%乙醇中,在水浴上(85oC)热回流提 取2次,每次3h,抽滤,合并2次滤液,在水浴上蒸馏,除去溶 剂,用石油醚脱脂2次,水液在水浴上蒸至浆液状,控制在 6O?以下干燥可得提取物. 1.2.595%乙醇超声波提取法称取5.0g干鹅掌柴根, 茎,叶粗粉,浸泡在75mL95%乙醇中,超声波(功率200W) 提取2.5h后抽滤,滤渣再浸泡在75mL95%乙醇中,超声波 提取2.5h后抽滤除渣,合并2次滤液,在水浴上浓缩至原体 积的一半,然后用石油醚(60,90?)脱脂2次,水液在水浴 上蒸至浆液状,控制在6O?以下干燥可得提取物. 1.2.6植物样品中总黄酮质量分数计算植物样品中总黄 酮质量分数(以芸香苷计,%)=[(m.XmXV1)/(m:×m× )]×100%.式中:m为所测样品液中总黄酮量(mg);m 为配制样品使用液时所称粗提浸膏质量(mg);m为粗提浸 膏总量(g);m为植物样品总干重(g);Vl为配制的样品溶液 总体积(mL);为测量时所取样品溶液体积(mL). 1.2.7精密度试验精确吸取浓度为0.1mg/mL的芸香苷 标准溶液5mL,具体操作见"1.2.8",连续测量6次,测定吸 光度值,结果表明,RSD值为0.31%,说明该方法仪器精密度 良好,结果见表1. 表1精密度试验结果 编号123456 吸光度0.4730.4720.4740.4720.4710.475 1.2.8标准曲线的绘制分别取0.0,1.0,2.0,3.0,4.0, 5.0mL的0.1mg/mL芸香苷标准溶液于6支比色管中,分别 加入0.3mL5%的亚硝酸钠溶液,放置6min,加入0.3mL的 10%硝酸铝溶液放置6min,再加1.0mol/LNaOH溶液 4.0mL,定容至10mL,摇匀.以空白溶液作参比,在A=510 nm处测吸光度.得到标准液浓度c与吸光度D之间的回归 方程. 1.2.9测定液的制备及测定精确称取5mg提取样品用 70%乙醇溶解,并用50mL容量瓶定容,获得浓度为 0.1mg/mL的溶解液.分别取0.1mg/mL的鹅掌柴根,茎,叶 溶解液5.0mL于比色管中,分别加入5%亚硝酸钠0.3mL, 摇匀,放置6rain,加10%硝酸铝0.3mL,摇匀,放置6rain,再 加1mol/LNaOH溶液4.00mL,加蒸馏水至刻度10mL,摇 匀,放置12rain,得测定液.在A=510nm处测定其吸光度. 2结果与分析 2.1芸香苷标准曲线 以吸光度D为纵坐标,浓度C为横坐标,绘制芸香苷标 准曲线,回归方程为D=8.823C一0.015,r=0.9999,结果表 明,浓度在0,0.05mg/mL浓度范围内线性关系良好. 2.2总黄酮含量测定 采用3种不同方法提取总黄酮,结果见表2,表3和表4. 表250%稀乙醇冷浸法提取总黄酮测定结果 由表2可知,采用50%稀乙醇冷浸法,鹅掌柴根,茎,叶 总黄酮含量分别为3.54%,2.01%,6.11%.叶片中含量最 高,茎中含量最低. 表370%乙醇热回流法提取总黄酮测定结果 由表3可知,采用70%乙醇热回流法,鹅掌柴的根,茎, 叶的总黄酮含量分别为4.48%,3.81%,7.14%.叶片中含 量最高,茎中含量最低,与采用50%稀乙醇冷浸法得到的结 果相似. 由表4可知,采用95%乙醇超声波提取法,鹅掌柴的根, 茎,叶的总黄酮含量分别为4.60%,3.95%,7.26%.叶片中 含量最高,茎中含量最低,与采用50%稀乙醇冷浸法和70% 乙醇热回流法得到的结果相似. 表495%乙醇超声波提取法提取总黄酮测定结果 2.3方差分析 方差分析结果表明,50%稀乙醇冷浸法,70%乙醇热回流 法,95%乙醇超声波提取法3种处理方法对根,茎,叶中总黄 酮含量的影响极显着(P<0.01). 2.4多重比较结果 3种不同提取方法和不同样品中总黄酮含量的多重性比 较结果见表5和表6. 由表5可知,50%稀乙醇冷浸法与70%乙醇热回流法差 江苏农业科学2010年第4期 表53种提取方法的LSD法多重比较结果分析 表6不同样品中总黄酮含量的LSD法多重比较结果分析 异极显着(P<0.O1),50%稀乙醇冷浸法与95%乙醇超声波 提取法差异极显着(P<0.01),70%乙醇热回流法与95%乙 醇超声波提取法差异不显着(P>0.05). 由表6可知,鹅掌柴根和茎中总黄酮含量差异极显着 (P<0.01),茎和叶中总黄酮含量差异极显着(P<0.01),根 和叶中总黄酮含量差异极显着(P<0.01). 2.5估计边缘均值比较 表7显示了提取方法不同水平的平均值,各因素水平对 结果影响的强弱顺序是:95%乙醇超声波提取法>70%乙醇 热回流法>50%稀乙醇冷浸法.根据多重比较结果,95%乙 醇超声波提取法与70%乙醇热回流法差异不显着,95%乙醇 超声波提取法与50%稀乙醇冷浸法的差异极显着. 表7不同提取方法的估计边缘均值比较结果 表8显示了样品不同水平的平均值,各因素水平对结果 影响的强弱顺序是:叶>根>茎.根据多重比较结果,叶和 根,叶和茎的差异均极显着. 表8不同样品的估计边缘均值比较结果 不同材料中总黄酮含量估计边缘均值比较结果表明:鹅掌柴根,茎,叶中,叶中总黄酮平均含量最高,茎中含量最少. 叶的总黄酮含量显着高于根和茎.不同提取方法得到的总黄 酮估计边缘均值比较结果表明:3种提取方法中,提取方法较 好的是95%乙醇超声波提取法和70%乙醇热回流法,提取效 果显着高于5O%稀乙醇冷浸法. 3结论与讨论 本研究表明,鹅掌柴叶中总黄酮的含量最高,95%乙醇超 声波提取法下叶中总黄酮含量达到7.26%,茎中含量最低, 为3.95%.95%乙醇超声波提取法提取效果较好,50%稀乙 醇冷浸法的效果最差.植物中总黄酮的含量差异很大,如磷 毛蕨总黄酮含量为1.79%,欧亚水龙骨营养叶总黄酮含量为 0.9%,蹄盖蕨的总黄酮含量为7.14%Ell—lZ].黄酮类化合物 在银杏叶中质量分数为1.9%左右,在银杏梗中的质量分数 为0.5%,0.7%,在外种皮中的质量分数为0.1%一 0.8%.大豆是黄酮含量较高的一种植物,如大豆提取物 中大豆总异黄酮的含量为38.1%.鹅掌柴中总黄酮含量 处于中间水平,有一定的提取价值. 目前,鹅掌柴中黄酮种类及各自含量还没有相关的文献 报道,本研究也未涉及,因此,鹅掌柴总黄酮种类的分离有待 进一步研究. 超声波提取法中,提取时间对提取效果有一定的影响,本 研究是依照参考文献[9]的提取方法进行的,而大多参考文 献选择的提取时间是30minl】,鹅掌柴叶中总黄酮的提取及 测定条件有待进一步完善. 参考文献: [1]徐杰,彭新君,李文欣.鹅掌柴属植物化学成分,药理及临床应 用概况[J].湖南中医药大学,2006,26(5):62—64. 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