【doc】透射电镜的孢粉制样技术
透射电镜的孢粉制样技术 电于显微学!干]币0c.J-
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透射电镜的孢粉制样技术
周忠泽庄永龙
(安徽大学生命丐孺室,合肥230039)
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花粉壁的构造提供了若干在系统发育上有用的特征.其中外壁的层次,结构1,2及纹饰是基本
的.近年来由于薄切片技术及透射电子显微镜的应用.许多先前在光学显微镜下无法分辨的微观
特征+包括花粉外壁的层次,结构等方面的微观差异都被清晰地揭示出来一从而为某些疑难类群
的分类划界和系统位置提出了颇有价值的信息.因此透射电镜在孢粉学和植物分类学领域应用
越来越广泛但是由于原来的透射电镜的单一的制样技术.处理样品程序多,周期长?大大妨碍'r
人们对透射电镜的使用.近年来,作者用透射电镜观察植物孢粉时,摸索出几种制样技术,具体介
绍如下.
孢粉包埋切片法
1)取大量新鲜的刚开放的植物小花或大量孢子囊(堆);2)用冰醋酸浸泡过夜;3)用玻棒将整个
小花连同花药或孢子囊捣碎;4)过筛去花被片,叶片等杂质得到较为纯净的花粉或孢子,离心?
弃上清液;5)在2温热的琼脂中离心花粉粒,离心后将琼脂切成小块;6)用乙醇进行梯度脱水
(3.05079%9095%1OO),每一浓度中停留3,5rain,100乙醇换液三次;7) 用100乙醇:包埋剂:3:1.1:1,1;3的比例浸透,每步30rain,8)浸透后用纯树脂进行包 埋;9)将包埋块放入60?恒温箱中聚合48h;10)用超薄切片机切片,切片厚度70,9Ohm;1])
切片收集在未喷镀碳膜的300~400目铜阿上.用醋酸双氧铀及柠檬酸铅进行双重染色,待样品
干燥后即可用透射电镜观察并拍摄电镜照片.该方法的优点是;能确保每次成功.缺点是:?样
品花粉或孢于必须数量多?处理样品程序多,周期长@适用范围小,如从腊叶标本上取的单
朵小花或少量孢于囊则不适用
花药包埋切片法
1)取新鲜的刚开放的植物大花里较大(3,5ram)的花药;2)用乙醇进行梯度脱水(30 jo70%一g095一一100%),每一浓度中停留3,5rain,100%乙醇换液三次{3)按常规 程序渗透,包埋;4)用超薄切片机切片,切片厚度70~90nm;5)切片收集在未喷镀碳膜的300,
400目铜网上+用醋酸双氧铀及柠檬酸铅进行双重染色.待样品干燥后即可用透射电镜观察并拍
摄电镜照片.该方法的优点是:?能确保每次成功.?处理样品程序少,周期短.?也适用于腊
叶标本上取的大花药,如术兰科,百合科的花药,其处理步骤更简化,可以直接从渗透开始,即从
孢粉包埋切片法的第7步骤即可缺点是:适用范围仍然小+即花药必须达到一定大的体积,至少
,5ram以上+花药2mm以下则很难包埋切片 长度要3
整花包埋切片法
1)取新鲜的刚开放的植物小花(2mm以下),在解剖镜下除掉部分花被片;2)用乙醇进行拂度脱
水(30一50--799095一1O0),每一浓度中停留3,5min+1O0乙醇换液三次;
3)按常规程序渗透,包埋;4)用超薄切片机切片.切片厚度70,9Onto;5)切片收集在未喷镀碳膜
基盒项目:安徽省自然科学基金资助项目(9904z4
电子显箍JChinE[ectr.Microsc.Soc l9(3){3833842000年
的300~400目铜网上,用醋酸双氧铀及柠檬酸铅进行双重染色.待样品干燥后即可用透射电镜
观察并拍摄电镜照片.该方法的优点是:?能确保每次成功.?处理样品程序少.周期短.?也适
用于腊叶标本上取的小花,如蓼科,菊科的花,其处理步骤比处理新鲜小花要多,步骤.即先将小花
放在蒸馏水中,反复抽低真空,使整个小花沉人水中,60?恒温箱中保温24h,在解剖镜下除掉部分
花被片,后面的脱水,渗透,包埋步骤相同?既可以克服孢粉包埋切片法的花粉样品必须数量多,
又可以克服花药包埋切片法的花药必须体积大的缺点.该方法与孢粉包埋切片法的区别是该方法
的花粉粒不经醋酸酐法处理,因此花粉内部的生活物质及柔软的内壁都被保留下来(图2,图4).
围l醋酸酐法处理过的拳蓼花粉(Bar—lore);闺2未经醋酸酐法处理过的齿翅蓼花糟
(Bar=l~na){图3t4未经醋酸酐法处理过的何首乌花粉(Bar—l0gtm.Bar—lgtm) 结论
(1)孢粉包埋切片法及花药包埋切片法是在传统方法上的改进,即省略固定的步骤传统的
方法是在样品脱水和包埋前要将样品花粉或花药用2的戊二醛及1,2的四氧化锇进行固
定,因为透射电镜的薄切片技术主要研究的是花粉的外壁结构,而花粉的外壁是由
抗分解能力的
孢粉素组成的,而不是研究花粉里面的原生质体,因此不需要固定液固定. (2)腊叶标本上的大花,可以取一个大的花药直接进行渗透和包埋. (3)腊叶标本上的小花,在进行渗透和包埋前,必须要用水浸泡并去掉部分花被片,否则包埋剂
不能渗透人花粉.这种整花包埋切片法是我们在实验中摸索出来的新方法. 参考文献
[1]戴太临,张清艟主编生物医学电镜样品制备方法.天津天津太学出版社,l993.21—22.
[2]洪涛主编生物医学超微结构与电子显微镜技术(I)北京;科学出版社.1984.
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