超滤管使用方法和注意事项

.超滤管使用方法和注意事项蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管,常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管〔MWCO10kD〕.也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选,视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定.可重复使用,使用一次就扔掉太浪费.以下是 个人总结 关于高中教师个人总结个人总结模板员工个人总结大二学年个人总结小学英语教师年度考核个人总结 的使用方法和注意事项.1、选择合适的超滤管,主要考虑MWCO和浓缩体积,最常见的是Ultra-15〔10kD〕.到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量为35kDa,就可以选择10kDa截留分子量的超滤管.若目的蛋白分子量为10kD左右,则可以用截留分子量3kD的超滤管.认真阅读使用说明书,注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 格中有.2、新买来的超滤是干燥的,使用前加入MilliQ水,水量完全过膜,冰浴或冰箱里预冷几分钟.然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶的白线为准.操作要轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷.3、平衡.质量和重心二者都要达到平衡.注意转速和加速度不可太快,否则直接损坏超滤膜.开始离心超滤〔离心机预冷至4度〕.不同离心机的转速rpm换算成g之后,有所不同.具体可参阅附件里的说明书.离心机的加速度调至最低档,减小对膜的压力.注意,一定要等离心机达到目的转速之后,方可离开离心机,否则离心机出问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 时,无法第一时间处理,后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整〔角转离心机的情况是膜与轴垂直〕.在实际使用中,一般转速开的比说明书里的要低,这样可以延长离心管的使用寿命.4、当浓缩到剩下1ml时,[取50ul国产Bradford溶液,加入10ul流穿,看有没变蓝色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白.如果管漏了,将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤.要精确判断是否漏管,用5mg/ml的BSA离心10min,再取流穿,跑蛋白胶或Bradford粗测],继续加入剩下的蛋白液浓缩〔在冰上操作,防止蛋白受热〕,直到所有浓缩液都加完为止.离心过程中注意是否发生蛋白沉淀,导致堵管.若发生沉淀,要确定沉淀的具体原因,是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后者的方法是换不同的Buffer,直到蛋白不发生沉淀为止.5、前面几步用以浓缩蛋白,如果要换Buffer,在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候,轻轻加入新的Buffer〔经0.22um超滤膜超滤〕,再浓缩至1ml左右,连续三次,最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,一般不多于500ul,也有浓缩至200ul以内的情况.按照每次至少10倍左右的体积浓缩算,三次达到1000倍以上,基本上可以达到换buffer的目的.6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作,用黄枪头〔200ul〕取,轻轻顺着边缘插入枪头,轻轻吹打、混匀蛋白液,注意不要碰到超滤膜,然后吸取浓缩液,每次吸接近200ul,直到吸完.管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取,否则难度太大,1/5.有可能损坏超滤膜.最后加入MilliQ水到超滤管中,没过超滤膜,防止膜失水变干.7、以下是处理超滤管,重复利用超滤管的步骤.8、倒出超滤管里的水,用milliQ水轻轻润洗几次,[若管底有可见的蛋白沉淀,可以先加入水,然后用枪头吹打,注意不要碰到膜,吹打至沉淀悬起,然后倒掉,不可用自来水猛冲]然后加入0.2M的NaOH溶液,室温放置20min,期间平衡超滤管.再离心10min.倒出残留的NaOH溶液,将管芯浸入MilliQ水的烧杯<1或2L>中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时,不断稀释NaOH浓度.50ml管和盖子用自来水洗,内壁再用MilliQ水洗干净.9、取出浸没的管芯,加至接近满的MilliQ水,50ml管也加满MilliQ水,将管芯慢慢放入50ml离心管,排出部分水,然后盖上盖子,放4度保存,直到下次使用.一般来说,按照上述步骤和注意事项,每根管用三四年不会坏.实验室常用储存液的配置参数1．30%丙烯酰胺溶液[配制方法]将29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中.加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml.用Nalgene滤器〔0.45μm孔径〕过滤除菌,查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温.[注意]丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性.称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具.可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料.一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子,在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂〔MB-1Mallinckrodt〕,搅拌过夜,然后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之.在贮存期间,丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸.2．40%丙烯酰胺[配制方法]把380g丙烯酰胺〔DNA测序级〕和20gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中.继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理,但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L.[注意]见上述配制30%丙烯酰胺的说明,40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定.3．放线菌素D溶液[配制方法]把20mg放线菌素D溶解于4ml100%乙醇中,1：10稀释贮存液,用100%乙醇作空白对照读取OD440值.放线菌素D〔分子量为1255〕纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21,900,故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182,放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中,保存于-20℃.[注意]放线菌素D是致畸剂和致癌剂,配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作,而不能在开放在实验桌面上进行,谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤.药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂.只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度,这类制品便可用于抑制自身引导作用.2/5.4．0.1mol/L腺苷三磷酸〔ATP〕溶液[配制方法]在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH调至pH值至7.0,用蒸馏水定容1ml,分装成小份保存于-70℃5．10mol/L乙酸酰溶液[配制方法]把770g乙酸酰溶解于800ml水中,加水定容至1L后过滤除菌.6．10%过硫酸铵溶液[配制方法]把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中,该溶液可在4℃保存数周.7．BCIP溶液[配制方法]把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐〔BCIP〕溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃8．2×BES缓冲盐溶液[配制方法]用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N,N-双〔2-羟乙基〕-2-氨基乙磺酸]、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4,室温下用HCl调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成小份,保存于-20℃.9．1mol/LCaCl2溶液[配制方法]在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl2?6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10ml小份贮存于-20℃.[注意]制备感受态细胞时,取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml,用Nalgene滤器〔0.45μm孔径〕过滤除菌,然后骤冷至0℃.10．2.5mol/LCaCl2溶液[配制方法]在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2?6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃.11．1mol/L二硫苏糖醇〔DTT〕溶液[配制方法]用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液〔pH5.2〕溶解3.09gDTT,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃.[注意]DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理.12．脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕溶液[配制方法]把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右,用微量移液器吸取0.05mol/lTris碱分别调节每一dNTP溶液的pH值7.0〔用pH试纸 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〕,把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释,在给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度,然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP,分装成小份贮存于-70℃.13．0.5mol/lEDTA溶液[配制方法]在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠〔EDTA-Na?2H2O〕,在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调节溶液的pH值至8.0〔约需20gNaOH颗粒〕然后定容至1L,分装后高压灭菌备用.[注意]EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0,才能完全溶解.14．溴化乙锭〔10mg/ml溶液〕[配制方法]在100ml水中加入1g溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,保存于室温.[注意]小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性,使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套,称量染料时要戴面罩.3/5.15．2×HEPES缓冲盐溶液[配制方法]用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2PO4?2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES,用0.5mol/lNaOH调节pH值至7.05,再用蒸馏水定容至100ml.用0.22μm滤器过滤除菌,分装成5ml小份,贮存于-20℃.16．IPTG溶液[配制方法]IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷〔分子量为238.3〕,在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后,用蒸馏水定容至10ml,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃.17．1mol/L乙酸镁溶液[配制方法]在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁,用水定容至1L过滤除菌.18．1mol/LMgCl2溶液[配制方法]在800ml水中溶解203.4gMgCl2?6H2O,用水定容至1L,分装成小份并高压灭菌备用.[注意]MgCl2极易潮解,应选购小瓶〔如100g〕试剂,启用新瓶后勿长期存放.19．β-巯基乙醇〔BME〕溶液[配制方法]一般得到的是14.4mol/L溶液,应装在棕色瓶中保存于4℃.[注意]BME或含有BME的溶液不能高压处理.20．NBT溶液[配制方法]把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml70%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃.21．酚/氯仿溶液[配制方法]把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/LTris?HCl抽提几次以平衡这一混合物,置棕色玻璃瓶中,上面覆盖等体积的0.01mol/lTris?HCl液层,保存于4℃.[注意]酚腐蚀性很强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套与防护镜,穿防护服.所有操作均应在化学通风橱中进行.与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇.22．10mmol/L苯甲基磺酰氟〔PMSF〕溶液[配制方法]用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml〔10mmol/L〕,分装成小份贮存于-20℃.如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液〔100mmol/L〕.[注意]PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛与皮肤,吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险.一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量水冲洗之.凡被PMSF污染的衣物应予丢弃.PMSF在水溶液中不稳定.应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中.PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快,且25℃的失活速率高于4℃.pH值为8.0时,20μmmol/lPMSF水溶液的半寿期大约为85min,这表明将PMSF溶液调节为碱性〔pH>8.6〕并在室温放置数小时后,可安全地予以丢弃.23．磷酸盐缓冲溶液〔PBS〕溶液[配制方法]在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L,在15lbf/in2<1034×105Pa>高压下蒸气灭菌20min.保存于室温.24．1mol/L乙酸钾〔pH7.5〕溶液[配制方法]将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中,用2mol/L乙酸调节pH值至7.5后加入纯水定容到1L,保存于-20℃.4/5.25．乙酸钾溶液〔用于碱裂解〕[配制方法]在60ml5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水,即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液.26．3mol/L乙酸钠〔pH5.2和pH7.0〕溶液[配制方法]在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节pH值至5.2或用稀乙酸调节pH值至7.0,加水定容到1L,分装后高压灭菌.27．5mol/LNaCl溶液[配制方法]在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L,分装后高压灭菌.28．10%十二烷基硫酸钠〔SDS〕溶液[配制方法]在900ml水中溶解100g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分装备用.[注意]SDS的微细晶粒易扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS,10%SDS溶液无须灭菌.29．20×SSC溶液[配制方法]在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠,加入数滴10mol/lNaOH溶液调节pH值至7.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌.30．20×SSPE溶液[配制方法]在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6gNaH2PO4?H2O和7.4gEDTA,用NaOH溶液调节pH值至7.4〔约需6.5ml10ml/LNaOH〕,加水定容至1L,分装后高压灭菌.31．100%三氯乙酸溶液[配制方法]在装有500gTCA的瓶中加入227ml水,形成的溶液含有100%〔M/V〕TCA.32．1mol/LTris溶液[配制方法]在800ml水中溶解121.91gTris碱,加入浓HCl调节pH值至所需值.应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值,加水定容至1L,分装后高压灭菌.[注意]如1mol/L溶液呈现黄色,应予丢弃并置备质量更好的Tris.尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值,但仍可向大多数厂商购得合适的电极.Tris溶液的pH值因温度而异,温度每升高1℃,pH值大约降低0.03个单位.例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为9.5、8.9和8.6.33．Tris缓冲盐溶液〔TBS〕〔25mmol/lTris〕[配制方法]在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱,加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4,用蒸馏水定容至1L,分装后在151bf/in2<1.034×105Pa>高压下蒸汽灭菌20min,于室温保存.
34．X-gal溶液
[配制方法]X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷.用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液.保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20℃.X-gal溶液无须过滤除菌.5/5