家畜卵母细胞冷冻保存研究进展

家畜卵母细胞冷冻保存研究进展 家畜卵母细胞冷冻保进展 李雪松,桑润滋 (河北农业大学动物科技学院,河北保定071001) 自Whittingham(1977)首次成功的报道冷冻一解 冻的小鼠卵母细胞活仔以来.国内外诸多学者对家 畜及人的卵母细胞冷冻保存进行了研究目前,已 有小鼠,家兔,牛等动物以及人的卵母细胞冷冻 成功,并得到了后代.在国内,山羊,绵羊,猪等家 畜的卵母细胞冷冻保存也已有报道.随着胚胎工 程技术的不断发展,卵母细胞的冷冻保存越来越受 到重视,这将推动卵母细胞的冷冻保存取得更大进 展 1抗冻保护剂 在卵母细胞和胚胎的冷冻保存时,需使用抗冻 保护剂,它可以改变细胞在冷冻过程中的物理化 学环境.减轻或避免冷冻,解冻过程中的冷冻损 伤.抗冻保护剂主要为一些易溶于水的低分子量 有机物及个别高分子有机物.常用的抗冻保护剂 分为渗透性抗冻保护剂和非渗透性抗冻保护剂两 大类. I.I渗透性抗冻保护剂 渗透性抗冻保护剂又称为细胞内液抗冻保护 剂,它们易于通过细胞膜.其中包括甘油,二甲基 亚砜(DMSO),乙二醇(EG),l,2一丙二醇(PROH), 乙烯醇,乙烯胺,乙酰胺等. 1.2非渗透性抗冻保护剂 非渗透性抗冻保护剂又称为细胞外液抗冻保 护剂.它们不渗入细胞内部.其中包括蔗糖,聚蔗 糖(Ficol1),葡聚糖,海藻糖,半乳糖,胎牛血清 fFCS),聚乙烯毗咯烷酮(PVP),聚乙烯乙二醇,左旋 糖苷,牛血清白蛋白(BSA)等. 2卵母细胞冷冻保存方法 2.1常规冷冻法 常规冷冻法又称慢速冷冻法.该法一般以 DMSO,甘油,EG,PROH等作为抗冻保护剂,经过 由低浓度到高浓度的抗冻保护剂处理三到四步 后,投入液氮中保存.其主要目的是使卵母细胞逐 步的适应高浓度的抗冻保护剂,使抗冻保护剂能 充分的渗透到细胞中去.这种方法的一般程序为: 从室温以1?/min的速度降至一6"12,7~C以后,进 行人工植冰.保持lOmin.再以0.1oC/min,0.5~C/min 的速度降至一30?一80?,然后投入液氮中保存.李 辉等(2002)采用常规冷冻法保存绵羊的卵母细 胞.解冻后形态正常率为79.71%,体外受精后的卵 裂率为26.06%,并且其中有30.23%的胚胎发育达 8细胞以上.刘海军等(2003)采用程序冷冻法对山 羊GV期卵母细胞,培养9h的卵母细胞和IVM卵 20o5年第2l卷第4期o16 母细胞进行冷冻保存,解冻后形态正常率分别为 83.6%,84.0%和85I8%,前二者的卵母细胞成熟率 分别为19.7%和20.6%.由于该法在冷冻过程中会 形成冰晶,容易损伤细胞,而且操作复杂,耗时长, 需要昂贵的降温设备.这均是其在生产中推广受限 的一些影响因素.于永生等(2002)采用常规冷冻法 冷冻牛的卵泡卵母细胞,经体外受精获得了l1.1% 的受精率和5.6%的卵裂率. 2.2玻璃化冷冻法 自Rall等(1985)用玻璃化法成功的保存了小 鼠的胚胎以来.经过国内外诸多学者的改进,冷冻 方法已基本成熟.玻璃化冷冻法因其耗时短,而且 无需昂贵的程序降温仪,从而受到众多人士的青 睐该法一般采用高浓度的玻璃化溶液作为冷冻 保护液.它由多种抗冻保护剂按一定比例混合而 成,因其浓度高,低温时会变得黏稠,不形成冰晶, 而是形成无规则的玻璃样固体,这就有效的减少 了对细胞的冰晶损伤.但卵母细胞暴露在玻璃化 溶液中的时间应严格控制在一定范围之内,否则 高浓度的抗冻保护剂会对细胞产生毒害作用. 2.2.1细管法 此法以0.25|lll细管作为承载卵母细胞的工 2002)以甘油和EG作为抗冻保护剂, 具.李辉等( 将绵羊的卵母细胞经两次平衡后,移入玻璃化溶 液0.5min内投入液氮保存.解冻后形态正常率为 94.30%,体外受精后的卵裂率为31.87%,并且其中 有32.76%的胚胎发育至8细胞以上.李青旺等 (2003)采用一步法和二步法对牛的GV期卵母细胞 和IVM卵母细胞进行了冷冻保存,试验结果表明, 二步法的冷冻效果着优于一步法. 2.2.2OPS法 0Ps法即开放式拉长塑料细管法(openpulled straw),是南丹麦人Vajta.G于1996年发明的.在国 内,朱士恩等(2002),谭世俭等(2002)用不同的加 热条件制备了0Ps管,并用于牛的卵母细胞的冷 冻保存.OPs管内径一般为0.8,1Omm,管壁厚度 在0.08mm左右,约为正常0.25ml细管原来直径和 管壁厚度的一半.0PS法的冷冻速度可达2o0l00? /rain.是细管法的10倍左右,极大的降低了冷冻损 伤装管时.将含有卵母细胞和抗冻保护剂的}昆合 物,利用毛细管的虹吸作用,并吸入0Ps管中,投 入液氮中保存.解冻时,只要将0Ps管细端浸入一 定温度的解冻液中,卵母细胞和胚胎就会由于沉降 作用而进入解冻液中此法操作简单,效率高.冷 海军等(2003)用OPS玻璃化法对山羊的GV期卵 母细胞,培养9h的卵母细胞和IVM卵母细胞进行 冻保存,解冻后形态正常率分别为84.1%,83.0%和 83.8%,前二者的卵母细胞成熟率分别为27.6%和 30.9%,并且得出了OPS法在解冻后的卵母细胞成 熟率,受精率和卵裂率等指标均高于程序冷冻法 的结论.VajtaG(1998)采用0Ps法对牛的卵母细胞 进行了冷冻保存,体外受精后,获得了25%的囊胚 率.据谭世俭等(2002)报道,牛卵母细胞在IVM2lh 后用0Ps法玻璃化冷冻,体外受精后获得了48.2% 的卵裂率和22.8%囊胚率.HurttAE等(2000)使用 0Ps玻璃化法成功的冷冻了马的卵母细胞. 2.2.3电子显微镜铜网法 此法以电子显微镜铜网作为承载工具.采用不 足lul的小体积冷冻液和液氮直接接触.其冷冻速 率可达30o0?/min.该法可使卵母细胞迅速的经过 致死温区,但由于此法冷冻操作过程较复杂.导致 其应用受限.Martino等(1996)采用该法对牛成熟卵 母细胞进行了冷冻保存,体外受精后.卵裂率可达 30%. 2.2.4微滴法 此法不使用任何承载物.将胚胎于抗冻保护剂 中平衡一段时间后,将约6ul的含有卵母细胞的冷 冻液小滴直接滴人液氮中.然后将这种小颗粒置 于小管中,放人液氮中保存.微滴法最早应用于小 鼠的胚胎保存.该法的缺点是容易造成胚胎或卵 母细胞的丢失和污染.同时不便于冷冻过程中对 胚胎或卵母细胞进行标记.有人提出,为了防止胚 胎的污染问题可将液氮进行过滤除菌后再使用. 2.2.5SSV法 SSV法即坚硬表面玻璃化法(solid—surfacevit— rification),是Dinnves等(2000)在微滴法的基础上 改进而来的一种新方法.此法将包有锡纸的金属 块作为冷冻载体,使其部分浸入到液氮中,其表面 温度可达一150—180?.然后将含有卵母细胞的玻 璃化溶液微滴(1,2u1)滴在金属块表面即可.该法 将无容器的微滴玻璃化与冷的金属表面热交换增 加的优势结合起来,而且洁净的金属表面利于微 滴的无菌操作.有人已在牛的卵母细胞冷冻保存 上使用了SSV法.BeginI等(2003)曾用SSV法冷 冻了山羊的卵母细胞.未得到满意的结果. 2.2.6CLV法 即冷环玻璃化法(Cryo—loopvitrification),该降 温速度快,以Cryo—loop作为胚胎的承载工具.将 直径为0.5,0.7mm的Cryo—loop固定在具有小磁 球的不锈钢锥顶上.Cryo—loop法最早应用于小鼠 和人胚胎的冷冻保存.该法的基本操作程序为:首 先将胚胎在一定浓度的抗冻保护剂中预处理一段 时间.然后把胚胎移到附有玻璃化溶液的Cryo— loop上.30s之内将其投入浸在液氮中的冷冻管 中.BeginI等(2003)用CLV法冷冻了山羊的卵母 细胞获得了89%的存活率,与对照组差异不显着. 3冷冻保存对卵母细胞发育潜力的影响 由于冷冻保存对卵母细胞的结构造成了一定 程度的损伤,从而导致解冻后的卵母细胞发育潜力 明显下降. 3.1在实体显微镜下观察解冻后的卵母细胞 发现,冷冻对卵母细胞最明显的损伤是卵母细胞和 卵丘细胞的分离,有的部位卵丘细胞脱落,局部质 膜内陷.由于卵丘细胞参与卵母细胞的成熟.卵丘 细胞的脱落则会降低其成熟率.虽然已成熟的卵母 细胞周围是否有卵丘细胞不影响其冷冻后的发育 潜力,但对于未成熟的卵母细胞来说.冷冻后卵母 细胞的存活及发育潜力与卵丘细胞层数有关.卵丘 细胞对未成熟卵母细胞起到保护和营养作用.因 此,冷冻一解冻过程中引起的卵丘细胞分离及脱落 是使卵母细胞发育潜力下降的重要原因之一. 3,2在解冻后的卵母细胞中发现.个别的卵 母细胞的透明带及质膜破裂,微绒毛减少或消失. 与多细胞的胚胎不同.卵母细胞膜一旦破坏.即使 是很小的破坏.也会使其失去发育能力,因为细胞 膜不仅对细胞的存活起重要作用,而且还参与受精 时精卵质膜的融合.另外,微绒毛的丢失可能会影 响受精过程,因为正常受精时,精子质膜不与缺乏 微绒毛区域的卵膜融合.此外,微绒毛的减少或消 失.可增加卵质膜的表面积.使卵母细胞解冻时过 度膨胀.引起透明带破裂. 3I3冯怀亮(1995)将解冻后的卵母细胞和未 经冷冻的卵母细胞分别用蛋白酶溶解其透明带,结 果发现冷冻后的卵母细胞的透明带对蛋白酶的抵 抗力增强.这可能是引起受精率下降的重要原因之 0 3.4由于冷冻造成了细胞骨架的破坏,引起了 微丝,微管的解聚:抑制了卵母细胞的成熟和受精 过程中将要发生的细胞器的重排;同时,还抑制了 纺锤体的形成.使卵母细胞无法进行正常的减数分 裂. 3.5据MenII等(2003)报道,无论是慢速冷冻 法还是玻璃化法均会对卵母细胞的DNA造成损 伤. 3.6Lim等提出,冷冻造成的卵母细胞发育潜 力下降与胞质内蛋白质合成受损有关.但这一点是 有争议的. 3,7冷冻虽然对卵母细胞的线粒体,内质网等 细胞器也造成了一定的破坏,但经体外培养后线粒 体的嵴是可以再生的,在加上有少量的线粒体是没 有受到损伤的,冷冻解冻后膨胀的内质网体外培养 后也可恢复,因此冷冻解冻过程中线粒体和内质网 的损伤对卵母细胞的发育成熟并不是致命的. (参考文献略)口 17o20o5年第21卷第4期