实验六 菌落的PCR鉴定
【实验目的】
通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。
【实验原理】
重组子经过蓝白斑筛选后(具有假阳性),接下来可通过菌落PCR
方法
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对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为PCR扩增
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。采用外源基因特异性引物进行扩增,如果重组质粒转化入宿主细胞,则可以扩增得到预期大小的目的片段。
【实验步骤】
用200 μL的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 μL无菌水中,
吹打混匀,从中取2μL菌液作为菌落PCR模板。
1.在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系:
反应物 体积/μL
模板DNA 2.0
灭菌蒸馏水(ddH2O) 10.3
10×PCR 缓冲液 2.0
dNTP (2.5mM) 1.6
引物1 (2μM) 2.0
引物2 (2μM) 2.0
rTaq 酶 (1.0单位) 0.1
Total 20
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀,6,000 rpm离心15 sec使反
应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置:
① 94 ℃ 预变性 3 min;
② 94 ℃ 变性 30 sec;
③ 64 ℃ 退火 30 sec; 30 cycles
④ 72 ℃ 延伸 1 min;
⑤ 72 ℃ 延伸 3 min;
⑥ 16 ℃ pause
反应结束后短暂离心,置4℃ 保存备用。
配制1%的琼脂糖凝胶。
4.取5μL PCR产物加1μL 6×loading buffer于1%的琼脂糖凝进行电泳
剩余的13 μL菌液置4℃ 保存备用。
【结果与分析】
3
2
1
4
本实验扩增片段长652 bp。
由图可知,1、4泳道没有条带,说明目的基因没转入感受态细胞。可能的原因是连接体系有外源性核酸酶污染,使T-载体变为平端,连接后由于移码,而生成白斑。而2、3号泳道目的基因已成功转入感受态细胞中,所得片段大小符合目的片段。