AN142 用氨基酸直接分析法测定色氨酸

AN142 用氨基酸直接 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 法测定色氨酸 AN142 用氨基酸直接分析法测定色氨酸前言 由于在蛋白质和多肽水解制样过程中色氨酸会发生化学分解，所以蛋白质和多肽中色氨酸的测定是比较困难的。因此人们发展了许多方法来单独保存和测定这种氨基酸。为了保存色氨酸，可将一些硫醇抗氧化剂如巯基乙酸、亚硫基二乙酸或十二烷基硫醇12等被加入到6 N 盐酸溶液中。加入苯酚的做法也有报道3-5。另外采用对甲基苯磺酸6，含 3-2-氨基乙基吲哚的甲基磺酸7和巯基甲基磺酸89取代盐酸进行样品水解可以改善色氨酸的回收率。 人们也对碱水解进行了研究，并已经证明碱水解对色氨酸的回收率要优于酸水解10。在进行碱性水解时加入一些还原性试剂如锡矿11、或抗氧化剂如淀粉12、或其他保护剂如乙酸铅和组胺酸铅的混合物13等可以改善色氨酸的回收率。水解时用聚丙烯试管代替硼硅玻璃试管也能够提高色氨酸的回收率14。在进行碱性水解时采用氢氧化钠代替氢氧化钡可以防止色氨酸的沉淀和吸附。另外在真空或者惰性气体保护下进行水解也可改善色氨酸的回收率。 在早期的旨在提高灵敏氨基酸测定回收率的水解技术的研究开发中，人们认识到色谱分离技术是一个可提高测定特异性和消除干扰的方法。Spackman Moore 和 Stein 等的开创性的研究工作建立了最为广泛的为人们接受的氨基酸分析方法，那就是阳离子交换色谱法1215-22。这种柱后衍生方法使用 Moore 等发展的二甲亚砜-茚三酮试剂来提高测定的灵敏度。后来人们也研究了使用淀粉柱14、凝胶过滤24和气相色谱25等分离技术。上世纪七十年代反相高效液相色谱RP-HPLC的发展引出了氨基酸的柱前衍生快速测定方法26-28。 现在常用的测定色氨酸的方法是 AOAC 推荐出版的方法29。该方法使用氢氧化钠水解，水解后调节 pH，再经过离心处理，则所得到的清液就可以用氨基酸分析仪进行测定了。氨基酸分析仪并不仅仅使用于这种分析程序中，它还被经常使用在氨基酸的阳离子交换色谱和茚三酮柱后衍生方法以及氨基酸的反相液相色谱及其紫外或荧光衍生测定方法中。阳离子交换色谱测定氨基酸常常需要 1 h 时间，而反相色谱则仅仅需要 45 min 30。为了得到高到中级皮摩尔的色氨酸测定灵敏度，这两种方法或需要柱后衍生，或需要柱前衍生。衍生使得方法复杂化，并需要付出额外的劳动、花费，也给分析方法带来了一定的不确定性。在本应用方法中，我们将氨基酸直接分析方法应用于蛋白质、多肽、细胞培养液和发酵液中色氨酸的测定。该方法既能用阴离子交换色谱法AminoPacTM PA10直接分离常见氨基酸，又能用积分脉冲安培检测方法IPAD直接检测这些氨基酸3132。 在本方法中，我们给出了专门为从自由氨基酸、糖和多肽片段中快速将色氨酸淋洗分离出来的等度色谱程序。使用该方法色氨酸可被以非常高的灵敏度检测(低皮摩尔水平进样)。该方法将色谱运行时间减少至 12min，与传统方法相比，大大提高了分析效率。设备 Dionex BioLC 色谱系统，由以下部件组成:GP50 或 GS50 梯度泵，微孔，PEEK 材料流路，带有脱气装置;带有氨基酸金电极的 ED50 电化学检测器;AS50 自动进样器;配有25 L 进样环的可控温柱温箱;包括三个 2-L 塑料淋洗液瓶和压力 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的 EO1 淋洗液组织器。 PeakNet 色谱工作站。 Peacti-Therm III-Reacti-Block H 加热模块;真空水解管8×60 mm 1 mL。 带盖的微型离心管1.5 mL，聚丙烯;硼硅玻璃质地的 Pasteur 吸管。 高纯氮气、氩气和氦气;三路活塞阀。 真空管1/4 in.×5/8 in.;真空泵;0.2 m Nylon 过滤器;0.3 mL 微注射用小瓶。试剂和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 试剂:去离子水，17.8 MΩ-cm 或更好;无水乙酸钠Dionex 公司 AAA 专用;50氢氧化钠浓溶液w/wFisher;RBS-35 洗涤剂;一水葡萄糖J.T. Baker。 标准:色氨酸sigma。 样品:Luteinizing Hormone-Releasing Hormone 黄体激素-释放激素LH-RH Sigma;FW1182.3 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. 样品干重包含 90的多肽，该多肽的纯度为 98。每个分子中含一个色氨酸残基。 牛血清白蛋白BAS，7。此试剂为 NIST 标准参考物质。 大肠杆菌E. coli细胞培养液。 Bacto YPD 发酵液。条件色谱柱:AminoPac PA10 分析柱(2×250 mm)，AminoPac PA10 保护柱(2×50 mm)。柱温:30?(方法 1)或 40?(方法 2)。进样体积:10 L。 。流速:0.25 mL/min(方法 1)或 0.35 mL/min(方法 2)。淋洗液 A:water; 淋洗液 B:250 mM 氢氧化钠;淋洗液 C:1 M 乙酸钠;淋洗液 D:1 M 乙酸钠50 mM 氢氧化钠。在线脱气:每 4 min 脱气 30 s。检测:积分脉冲安培检测器，氨基酸直接分析用金检测池，标准复合 pH-Ag/AgCl 参比电极， pH 参比电极。背景:60-160 nC典型体系操作压力:2300-2540 psi 方法 1 3220-3560 psi 方法 2方法 1 操作程序:流速 0.25 mL/min，柱温 30?。 时间min A B C D 备注 开始 0 20 80 0 自动进样器充满样品 0.0 0 20 80 0 阀从“load”位置转至“injection” 30.0 0 20 80 0 运行结束方法 1 操作程序:流速 0.35 mL/min，柱温 40?。 时间min A B C D 备注 开始 0 0 0 100 自动进样器充满样品 0.0 0 0 0 100 阀从“load”位置转至“injection” 15.0 0 0 0 100 运行结束ED40/ED50 电化学检测器的波形 时间 s 电位相对于 pH 参比电极V 积分 0.00 0.13 0.04 0.13 0.05 0.33 0.21 0.33 开始 0.22 0.60 0.46 0.60 0.47 0.33 0.56 0.33 结束 0.57 -1.67 0.58 -1.67 0.59 0.93 0.60 0.13溶液和试剂配制水:水是用来配制和稀释样品的。由于在测时必须对样品进行水解，而样品水解时释放出的自由色氨酸在色谱中好象一个背景峰，该峰可使痕量分析大打折扣，因此痕量蛋白质杂质的存在对测定的影响将很显著。为了使用于样品稀释的水合格，在选定了水解程序后，必须测定体系的背景峰的大小。配制样品使用的过滤器必须合格。本实验使用的水必须是 18.3 MΩ-cm 或更好的去离子水，在使用前必须使用 Nylon 过滤器进行过滤，这样可使水中不包含具有电活性的表面活性剂或其他可淋洗杂质。淋洗液水必须置于 4-5psi 压力的氦气或氮气的保护之下，以减少吸收空气中的 CO2，并减少微生物污染。250 mMNaOH 溶液 为了配制 2 L 淋洗液，可将 26 mL 50的 NaOH 溶液与 1974 mL 的纯水混合，将这种溶液立即置于 4-5psi 压力的氦气或氮气的保护之下。1.0 M NaAc 溶液 为了配制 1 L 淋洗液，可将 82 g 适用于氨基酸直接分析的 NaAc 固体溶解在大约 800 mL水中，在添加水至总体积为 1 L 并摇匀即可。用 0.20 m Nylon 过滤器进行过滤，淋洗液水必须置于 4-5psi 压力的氦气或氮气的保护之下，以减少吸收空气中的 CO2，并减少微生物污染。注意如果使用其他的过滤器如纤维素或聚砜过滤器将会引入活性杂质。含 50 mM NaOH 的 1.0 M NaAc 溶液 为了配制 1 L 淋洗液，可将 82 g 适用于氨基酸直接分析的 NaAc 固体溶解在大约 800 mL水中，添加水至总体积为 1 L，用 0.20 m Nylon 过滤器过滤后，再加 2.6 mL 50的 NaOH溶液，摇匀后将此溶液立即置于 4-5 psi 压力的氦气或氮气的保护之下。样品溶液制备实验用品的准备 为了减少残留和降低方法的空白，应该用合适的洗涤剂清洗硼硅玻璃水解管。在本实验中，水解管是用 RBS-35 Pierce洗涤剂来清洗的。标准贮备液 将 51.1 mg 的色氨酸溶解在 10 mL 纯水中以配制 5.11 mg/mL 或 25 mM 色氨酸贮备液。工作标准 将 25 mM 色氨酸贮备液稀释 250 倍即可配制成 100 M 色氨酸溶液。再将此溶液进一步用水、4 M NaOH、蛋白质、多肽、葡萄糖、肉汤等溶液稀释配制成校正标准溶液，这些溶液可被用来试验不同基 体对回收率的影响。贮备蛋白质和多肽溶液 称适量商品蛋白质和多肽固体，将其溶解可配制得到贮备液。该固体由所需要的具有特定序列和组成的蛋白质和多肽，以及其他非需要序列和组成的杂质蛋白质、多肽和盐、缓冲溶液、吸附水等构成。其他杂质可能也会存在。蛋白质或多肽浓度的准确性将取决于这些成分的准确测量和在制备这些溶液时的质量校正。准确的蛋白质和多肽浓度对于得到蛋白质和多肽水解液中色氨酸的准确定量极其重要。 在本文中，称量固体多肽LH-RH后溶解于水中以配制浓度 1.0 mg/mL 的多肽溶液。水解试剂 4.4 M NaOH 溶液 将 2.3 mL50 NaOH 溶液与 7.7 mL 纯水混合可配得该溶液。水解液 将 100 M 蛋白质、多肽或色氨酸标准溶液用 4.4 M NaOH 溶液稀释 10 倍可配制得到10 M 的溶液。用移液管将这些 10 M 的溶液 300 L 转移入玻璃水解管，对此水解管上施加 20-25 in Hg 的真空度，然后用氮气或氩气充满水解管的顶空部分。经过 10 次抽真空和惰性气体的置换后，封死水解管，加热到 110?，在此温度的持续时间可在 10 min 到 24 h 之间。将不按照上方法加热的溶液作为零时间点的水解液。样品水解后，将水解液转移入微注射瓶中，直接注射 10 L 进行氨基酸直接分析。大肠杆菌细胞培养液 大肠杆菌细胞的培养是在保持 37?恒温的培养瓶中进行的，培养时应该以 280 转/min的转速进行搅拌。并分别在 0，1，2，3，4，5，6 h 的时间点取样，取样后立即以 16000×g的强度对样品进行离心处理 10 min 这样除去细胞及其细胞杂质等颗粒物。上层清液用水稀释 65 倍后，直接进 10 L 进行色氨酸的分析。酵母发酵肉汤 将 5.0 g Bacto YPD 肉汤溶解在 100 mL 水中，配制成浓度为 50 mg/mL 的溶液，用此溶液来进行酵母培养。将此溶液在 16000×g 的强度下离心 10 min取上层清液稀释 100 倍后直接进样进行氨基酸直接分析。将此 100 倍稀释液加入 10 M 色氨酸后按照同样程序测定以评价该方法在测定肉汤基体时的回收率。葡萄糖 将 2.0 g 葡萄糖溶解在 10 mL 水中，配制成浓度为 1.0 M 或 200 mg/mL 的溶液，将该溶液稀释 10 倍配成 100 mM 的葡萄糖溶液。将 1.0 M 葡萄糖溶液稀释 10 倍，并在其中加入10 M 色氨酸标准，用该溶液可以测定该方法在测定葡萄糖基体时的回收率。定量校正 将适量色氨酸溶解并定容为一定的体积，配制浓度为 1 M -1000 M 的色氨酸标准溶液，用此溶液来制作校正曲线。该曲线的峰面积斜率可用来说明方法的线性，并可用来对组分进行定量分析。该曲线的峰高斜率用来估计检测的低限和定量。日常的定量可用浓度为10 M 色氨酸单标所得到的响应因子进行。检测限和定量限 检测限LOD是由包含色氨酸色谱峰在内的 1 min 间隔的色谱基线噪音的 3 倍(峰高)除校正曲线的峰高斜率来计算的，定量限则是用 10 倍噪音按照类似方法计算的。结果和讨论色谱分离(选择性) 淋洗色氨酸的梯度就是以前发表的用来分离常见氨基酸的复杂梯度3133。方法使用的色谱柱是 AminoPac PA10，淋洗液是 700 mM 乙酸钠和 40 mM 氢氧化钠。在本实验中，我们采用了较高浓度的乙酸钠和氢氧化钠淋洗液，因此色氨酸的保留时间较短。随着氢氧化钠浓度的增加，检测器的响应也增加，但当其浓度大于 50 mM 后，检测信号将随氢氧化钠浓度的增加而降低。当柱温和流速增加时，保留时间也将缩短。另外流速和柱温的增加也会引起基线噪音的增大。基于这些原因，我们研究开发了如表 1 所示的两种方法。方法 1 采用了在氨基酸直接分析中推荐的流速、柱温和淋洗液33。方法 2 采用了较高的乙酸钠浓度，并将流速增大到 0.35 mL/min，温度增大到 40?。该方法将色谱运行时间由方法 1 的 18 min减少到 12 min。以前发表的氨基酸分析方法需要耗 时 75 min。由于方法 2 是在较高的流速和柱温下进行的，所以该方法的基线噪音较大。因此方法 2 适合于高通量的色氨酸分析，而方法 1 则适合于全部氨基酸的直接分析。图 1 是方法 1 和方法 2 测定所得的 10 M 色氨酸标准溶液的色谱图。 除尿刊酸外，色氨酸是最晚出峰的氨基酸。无论 使用方法 消防栓的使用方法指针万用表的使用方法84消毒液使用方法消防灭火器使用方法铁材计算器使用方法 1 还是方法 2，含磷氨基酸均在色氨酸前出峰，它们并不干扰色氨酸的测定。没有其他普通氨基酸和糖与色氨酸共淋洗。色氨酸不论是溶解在水中还是 4 M NaOH 溶液中，其保留时间总是相同的。历时 80 h，总共进行 144 次进样平行测定的保留时间的相对标准偏差为 0.6。 图1 采用方法 1 和方法 2 测定所得的 10 M 色氨酸标准溶液的色谱图表 1 快速色氨酸分析方法 方法 1 方法 2乙酸钠浓度(mM) 800 1000氢氧化钠浓度(mM) 50 50流速(mL/min) 0.25 0.35柱温(?) 30 40保留时间(min) 18.30 9.53基线噪音(pC) 62 121 6峰面积(×10 ) 11.18 8.64 3峰高(pC，10 ) 28.6 41.1进样为 10 L 的 10 M 的色氨酸溶液线性 图 2 是用方法 1 和方法 2 在 1 M -1000 M 浓度范围内测定色氨酸的校正曲线。由该图可以看出，如果浓度在 1 M –100 或 200 M 之间，则可进行线性校正。若浓度太高校正曲 图线则会发生明显的负偏离。 3 是在色谱柱超载的情况下得到的色谱图，从该图可以看出由于在高浓度时的低响应造成了色谱图的严重变形。另外使用不合格的乙酸钠会造成色谱响应的降低。 图2 采用方法 1 和方法 2 在 1 M -1000 M 浓度范围内测定色氨酸的校正曲线 图3 色谱柱超载时得到的色谱图色氨酸浓度为 5000 pmol检测限和定量限 方法 1 的噪音水平在 60-90 nC，方法 2 的噪音水平在 60-230 nC。两种方法均具有低至pmol 的检测灵敏度。表 2 给出了方法的检测限和定量限，从图可见两种方法的检测限在0.12-0.14 M 之间 ， (10 L 进样) 定量限在 0.14-0.46 M 之间。虽然方法 2 具有较高的噪音，但由于方法 2 具有较高的峰高响应，所以方法 2 也具有与方法 1 相近的检测限。表 2 方法的检测限和定量限 平均值?标准偏差(n 3) pmol M 检测限 a 定量限 b 检测限 a 定量限 b方法 1 1.4?0.5 4.6?1.6 0.14?0.05 0.46?0.16方法 2 1.2?0.3 4.1?0.9 0.12?0.03 0.41?0.09 a 以 3 倍信/噪比计算;b 以 10 倍信/噪比计算。精密度 历时 80 h，用方法 1 总共进行 144 次不间断进样平行测定的色谱峰面积的相对标准偏差为 2.4，前 12 次连续测定的峰面积的相对标准偏差为 1.7。随着时间的推移，没有观察到色谱峰面积向上或向下的变化趋势，这说明该方法是极其稳定的，这种表现可在图 4中清楚地观察到。 图4 历时 80 h，144 次不间断进样时平行测定色谱峰面积的相对标准偏差回收率 在不进行加热预处理的情况下， 但是在 110? 色氨酸能够从 4 M NaOH 溶液中完全回收。加热水解的情况下， 表 色氨酸会发生破坏分解。 3 给出的是在没有惰性气体顶空保护的情况下色氨酸从 4 M NaOH 溶液中回收时回收率随时间变化的情况。可看出色氨酸随加热时间的推移会不断分解。表 3 牛血清白蛋白在没有惰性气体保护的情况下进行碱性水解时色氨酸的回收率 色氨酸回收率 b()水解时间(h) 牛血清白蛋白 色氨酸平均回收率 b 平均值?标准偏差0 0.5?0.9 98.10.1710 min 12.3?0.9 98.30.530 min 38.2?2.4 82.91 68.3?1.5 68.72 75.3?0.9 44.73 67.6?0.7 38.14 56.2?1.5 24.75 40.5?0.7 17.36 37.5?0.6 5.27 30.6?1.0 5.28 24.4?0.6 2.415 6.1?0.4 2.624一天 4.0?0.3 2.331 2.6?0.2 NA96四天 3.6?1.0 NA a 在不加惰性气体的情况下，110?用 4 M NaOH 溶液水解时色氨酸的预期回收率。 b 在 18 h 内 3 次重复注射所得平均值及其标准偏差。 牛血清白蛋白中的色氨酸是在水解过程中释放出来的，在经过了 2 h 水解后其回收率值达到 75，其后随时间延长而降低。自由色氨酸在水解过程中其浓度会不断降低，经过 2 h后浓度仅仅为最初的 45。自由色氨酸吲哚基团侧链会与溶解氧作用生产其氧化产物，这些氧化产物不会在氨基酸直接分析中得到检测35-37。要对水解过程中的色氨酸损失进行校正是不可能的，其原因是自由氨基酸和由蛋白质水解生成的氨基酸在此过程中的损失程度并不相同。另外其他氨基酸、多肽片段和蛋白质的存在也许减少分解的速度。用惰性气体取代容器顶空部分的空气会减少其中氧的含量，从而降低色氨酸分解的速度。 1浓度的苯酚的 4 M NaOH 溶液可作为样品中氧的清除剂35，也可用 4 M 甲基磺酸代替 4 M NaOH 溶液，但是这样会引起较大的基线波动干扰，也会引起特别大的色谱峰歧变，并且甲基磺酸还会造成对 AminoPac PA10 色谱填料的损坏。 图 5 是浓度为 10 M 的色氨酸和牛血清白蛋白在氩气保护下在 4 M NaOH 溶液中 110? 图水解时的回收率。 6 是经过不同时间水解所得的蛋白质水解液色谱测定得到的色谱图。从图 6 可看出在水解时间 1-2.5 h 之间时，色氨酸能得到完全的回收，其中在 2.0 h 时达到 120的最大回收率。 图5 10 M 色氨酸和牛血清白蛋白在氩气保护下用 4 M NaOH 110?水解时的回收率其他样品基体中色氨酸的测定 本方法也可以用于其他样品基体中色氨酸的测定，这些样品基体包括:多肽水解液、高葡萄糖基体样品、细胞培养液和复杂细胞介质等。合理应用本方法对这些样品进行测定均能取得满意的结果。结论使用 AminoPac PA10 色谱柱在强的淋洗条件下建立起来的氨基酸直接分析法是直接快速测定色氨酸的有效方法。本注解提出的两种方法可以被用来快速测定蛋白质水解液中的色氨酸。该方法样品准备简单、不用衍生、劳动强度低。本注解提出的快速色氨酸测定方法使得对细胞培养和发酵过程的检测成为可能，这可实现培养条件的最佳化，并最终对提高生产率提供帮助。图6 经过不同时间水解所得的蛋白质水解液测定的色谱图参考文献1. Matsubara H. Sasaki R.M. “High Recovery of Tryptophan from Acid Hydrolysates ofProteins.” Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969 35 175-181.2. Bozzini M.L. Bello R. Cagle N. Yamane D. Dupont D. “Tryptophan Recovery fromAutohydrolyzed Samples Using Dodecanethiol..