OD值
1.朗伯——比尔(Lambert-beer)光吸收定律:
A=-lgT=εb c
A——吸光度,又称光密度“O.D”。
T——透光度,T=I / I。,I。——为照射到吸收池上的光强,I——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数(L·mol-1·cm-1)。
b——样品光程(cm),通常使用1.0cm 的吸收地,b=1cm。
C——样品浓度(mol/L)。
由上式可以看出:吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
2.DNA和RNA的OD值
2.1 原理
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰,因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值(图3-25),在230nm处为吸收低谷,其吸光率(absorbance)以A260
表
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示, A260是核酸的重要性质,RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处,对于纯的核酸溶液,测定A260,即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量,核酸的比吸光系数是指浓度为1μg/mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率,天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020,变性DNA和RNA 的比吸光系数为0.022。据朗波-比尔光吸收定律A=-lgT=εbc知,c=A/εb,而b通常为1cm,所以,通常以1OD值相当于50μg/mL双螺旋DNA,或40μg/mL单螺旋DNA(或RNA),或20μg/mL寡核苷酸计算。
2.2 纯度
DNA和RNA的纯度可以通过测定260nm,230nm和280nm的紫外吸收值来测定,纯的DNA OD260/280在1.8-1.9,OD260/230应大于2.0,纯的RNA OD260/280在1.9-2.0,如果DNA比值高于1.8-1.9,可能有RNA没有去除干净,如果DNA比值小于1.8-1.9,可能含有酚或者蛋白质(RNA中含有酚或者蛋白质比值也会降低),若OD260/230小于2.0说明有残存的盐或小分子杂质污染。
2.3 浓度
DNA和RNA的量,据朗波-比尔光吸收定律A=-lgT=εbc知测量样品的浓度为c= A/εb,又知ε=0.020,在b=1cm的情况下,c=A/(0.020×1)=50×A,则未稀释的样品的浓度为50×A×稀释倍数(μg/mL)=50×A×稀释倍数/1000(mg/mL)
2.4 注意事项:
1)比色杯应为石英杯,玻璃杯在此波长时读数不准。
2)
检测
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时应使OD260值在0.15 到1.0之间,数值比较准确。
3)这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于0.25ul/ml的时候,浓度小于0.25ul/
ml的时候测量误差较大。
4)既含有RNA又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8,这个时候要根据电泳情况鉴定是不
是含有RNA,或者测定一下是不是含有蛋白质;
5)A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考,但A260/A280 比值会受pH影响。如果
未调pH,比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值,建议在10 mM Tris Cl, pH 8.5
中检测,此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0(注意应使用同样缓冲液作为对照)。
6)进行OD值测定时,分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
7)可以在220-330 nm 之间进行扫描,此扫描可以检测是否有其它因素影响OD260,如在
325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)
8)DNA的量与260 nm处的吸光度值(OD值)成正比,在引物设计时,1个OD值的合
成DNA的重量约为33 mg。
浙公网安备 33021202002483