玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响

玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响 玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响 第24堂颦.2期上海交通大学(农业科学版)Vo1.24No.2 2006年4月JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITYfAGRICULTURALSCIENCE) Apr.2006 文章编号:1671-9964(2006)02.0121.06 玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响 朱淑文,张菁,华修国,朱秀萍,唐峰,徐动 (上海交通大学农业与生物学院.上海201101) 摘要:猪体外成熟培养的卵母细胞用平皿.微滴法玻璃化冷冻,冷冻解冻后对其超微结构损伤和正常的体外成熟培养的卵 母细胞进行了电镜观察比较.结果表明,玻璃化冷冻的卵母细胞解冻后有不同程度的结构损伤.包括:透明带破裂;微绒毛几 乎消失;有的部位质膜模糊甚至破裂;质膜下皮质颗粒减少;线粒体膨胀,电子致密度下降,嵴消失;大量囊泡在质膜周围变 形融合;细胞基质出现空白区.玻璃化冷冻引起卵母细胞结构损伤是导致卵母细胞解冻后存活力下降和受精率降低的主要 原因. 关键词:卵母细胞;平皿-微滴法玻璃化冷冻;超微结构;猪 中图分类号:$828.34文献标识碣:A UltrastructuralChangesinPorcine OocytesCryopreservedbyVitrification ZHUShu—wen,ZHANG.矗HUAXiu-guo,ZHUXiu-ping,TANG忍晦XUDong (SchoolofAgriculttlreandBiology,ShanghaiJiaotongUniv.,Shanghai201101,China) Abstract:Followinginvitromaturation.porcineoocyteswet?cryopreservedbydish-micmdmpme~odvitrification.Theporcine oocyteswerevitrified,themorphol0calynormalrateWBB39.94%,thecleavagerate(21.67 %)andblastoeystrate(7.69%)was significantlylowerthancontrolgroupCP<O.05).Theuhrastructureofvitrifiedoocytesw asassessedbytransmissionelectron血一 cmscopy(TEM)andcomparedwiththatofuntreatedcontroloocytesinordertodeterminethevariouskindsofultrastructmaldam- ageduetovitrification.Vitrificationinducedsomeultrastructuralchanges.suchaszonapellu cidacrack;thedisappearanceofal- mostallthemicmvilli;invagination,indistinctionandevenraptureoftheoolemma;fewercor ticalgranulesintheooplasm;the swellingofmitochondriatogetherwithreducedmatrixdensityanddisappearanceofcristae;t hevesiclesmigratedperipherallyin theooplasm.becameCOl1nuent;disorganizationofthematrix. Keywords:ooeyte;dish-rnicmdropme山od;vitrification:ultrastmcture;pomine 随着动物胚胎工程技术的迅速发展.卵母细胞的需求量急剧增加.卵母细胞冷冻保 存技术可充分利 用各种动物卵母细胞资源,为细胞核移植,转基因动物等提供丰富而方便的材料来 源,使这些高新技术不 受时问,地域限制,随时随地进行,从而为其走向实用化,商业化发展开辟道路. 玻璃化冷冻是一种不需要昂贵的仪器设备.简便快速的冷冻方法.成为低温生物学 领域的研究热点之 一 .高浓度的玻璃化冷冻液对卵母细胞的化学毒害作用较大.冷冻解冻后卵母细胞的 发育潜力明显受损. 因此,冷冻液含量的多少对解冻后卵母细胞的发育至关重要.王果等,】利用平皿玻 璃化冷冻小鼠卵母细胞获 得成功.由于猪卵母细胞与其他家畜相比对低温的耐受性差,这给猪卵母细胞的冷 冻造成了很大的困难闭. 关于猪卵母细胞冷冻保存研究尚处于探索阶段,特别是玻璃化冷冻对猪卵母细胞 的超微结构的影响等方面 收稿日期#2005.08.05 基金项目:上海市科委国际交流项目(015407005) 作者简介:朱淑3C(1960.).女,山东龙口市人,副教授,博士.研究方向:动物胚胎工程 122上海交通大学(农业科学版)第24卷 的研究,目前国内尚未见报道,本研究利用透射电镜技术对玻璃化冷冻后的猪卵母细胞冻解冻后的超微结 构变化进行了研究,旨在为研究猪卵母细胞的玻璃化冷冻机制提供理论依据. 1材料与方法 1.1卵丘.卵母细胞复合体的获取和体外成熟培养 摘取刚屠宰母猪的卵巢,放入27+2cC的生理盐水中,在2h内送回实验室,将卵巢用无菌生理盐水洗 涤3次.在卵巢门部用剪刀剪一个V字型口,轻轻挤出其中的血液,用灭菌吸水纸吸去卵巢表面的水分, 用带有l8针头的5mL一次性塑料注射器抽取卵巢表面直径为2-6mlIl的卵泡(注射器中吸有少量的D- PBS).将抽出的液体置于10IllL离心管中,放入37c(=恒温槽中,待l0—20rain后,将沉淀放于35Illml培养 皿中.在体视镜下选择卵母细胞质均匀,周围有5层以上卵丘细胞包被的卵丘.卵母细胞复合体(COCs), 移入NCSU37[31培养液中进行体外成熟培养.在前22h培养中该液体添加激素(PMSG和hCG),二丁酰环 腺苷酸(dbcAMP),后24h不添加激素和dbcAMP(SigmaD0627),在5%CO培养箱内(39cC,饱和湿度) 体外培养44—46h. 1.2玻璃化溶液的配制 按照王果等【l】报道的方法配制,基础液为TCM一199(GIBCO,12340.030)+3mg?imL,BSA. 冷冻液I:基础液+10%EG(Sigma,29323.7)+10%DMSO(Sigilla,D2650); 冷冻液II300g?L聚蔗糖(Ficoll70000)添加0.5tool?L-蔗糖(Sigma,S.9378),经基础液溶解后制成 Fs溶液. 玻璃化溶液:Fs液与EG+DMSO(等量混合)以6:4(V:V)比例配制成EDFS40. 1.3平皿.微滴法玻璃化冷冻及解冻一 卵母细胞成熟培养46h后,用吸卵针除去部分卵丘细胞,在7.5g-mL-1细胞松弛素B(Sigma,C6762) 中孵育10rain,10枚卵母细胞一组在50冷冻液I中平衡1Illin转移至50lxLEDFS40微滴中平衡 25-30s.将平衡后的卵母细胞移入在平皿圆型标记圈内,含有卵母细胞的EDFS40微滴体积小于0.5仙L, 迅速将带样品的35mill平皿浸入液氮至暴沸平衡,加上皿盖,并用金属夹固定后投入液氮罐储存2周.解 冻时迅速将平皿从液氮罐中取出,水平放置,松开金属夹,去掉皿盖,倾去皿内液氮后,空气放置108,37cI= 水浴锅内解冻.将50L含0.5tool?L-蔗糖的TCM一199溶液直接滴加到样品微滴上,收集卵母细胞移入 5OL新鲜的含0.5Illol-蔗糖的TCM.199及TCM一199溶液,室温各洗脱5min后将卵母细胞移入平衡 的NCSU一37培养液中洗2-3次,最后在成熟培养液中39c【=,5%C0,饱和湿度培养2h.设不经处理卵母 细胞为对照组. 1.4冷冻解冻后的卵母细胞的形态和体外受精后的胚胎发育 体外成熟的卵母细胞冷冻解冻后进行形态正常率及体外受精后受精率的统计,以解冻后,除去冷冻保 护剂,在C0z培养箱内培养2h后,透明带完整无断裂,胞质均匀,卵周隙清晰可辨的卵母细胞为形态正常 卵;按本实验室常规方法进行体外受精,观察卵裂率及胚胎发育情况. 1.5电镜样本制作 分别在体外成熟,冷冻液处理和玻璃化冷冻解冻后的卵母细胞每组3O枚中随机取出1O枚,用体积分 数5%戊二醛(4?)和质量浓度10g?L一的锇酸双重固定后,丙酮脱水,Epon812包埋,聚合,制作超薄切 片,用醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色,透射电镜(HitachiH.600型)观察. 2结果 2.1冷冻解冻后的卵母细胞的形态和体外受精后的胚胎发育 冷冻解冻后的卵母细胞与未冷冻的卵母细胞形态正常率见表l.解冻后的卵母细胞的形态正常率和 第1期朱淑文,等:玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响123 受精后的卵裂率分别为39.94%和21.67%,显着低于对照组的(P<O.05),异常卵可见质膜损伤,卵周隙不 清,卵质边缘模糊和固缩不均,部分卵质穿过卵膜进入卵周隙,局部质膜内陷,透明带及质膜破裂(图版). 显示玻璃化冷冻能造成细胞骨架系统的损伤.引起细胞皱缩和变形.经玻璃化冻融后,形态正常的卵母细 胞体外受精的卵裂率与对照组差异显着(尸<O.05). 表1平皿.微滴法玻璃化冷冻保存的猪卵母细胞的体外受精 Table1Dish-microdropletmethodvitrificatedporcineoocytesIVF 注:","表示没有:同一列数据上角标注字母不同者示P<0,05. Note:"/"indicatenone;Valueswithdifferentsuperscriptswiththesameparameterwassignifi cantlydifferent(P<O.05). 2.2玻璃化冷冻解冻后卵母细胞的超微结构损伤 玻璃化冷冻解冻的猪卵母细胞,表现出不同程度的超微结构的变化(见版图).在电镜下可以看到体外 成熟的卵母细胞卵质膜清楚完整.卵周隙内有竖起的微绒毛断面;线粒体多呈圆形分散在胞质中,并成团 分布于皮质区,靠近质膜,电子致密度高,在质膜下形成线粒体密集带;皮质颗粒成 排紧贴质膜,并在质膜 下呈单行线形排列,多数呈球形或椭圆形,具有单层界膜,内部基质中弥散着电子致密度较高的颗粒. 冷冻剂处理的卵母细胞中线粒体电子致密度降低,脂滴内絮状物减少,其余结构与正常的体外成熟卵 母细胞基本一致.极少数卵母细胞中出现质膜模糊,甚至破裂,卵周隙界限不清楚,微绒毛消失,皮质颗粒 消失;线粒体膨大,出现空泡,囊泡变形,聚集甚至融合,并迁移至细胞质膜周围,多数脂滴形态维持完整. 冷冻解冻后.卵母细胞超微结构变化主要表现在卵母细胞中透明带断裂;大多数卵母细胞质膜内陷, 模糊,甚至破裂,卵周隙界限不清楚,胞质内容物直接与透明带接触.微绒毛数量很少,许多部位微绒毛消 失;少数卵母细胞线粒体膨大,并出现空泡,嵴消失,但大多数线粒体形态完整,有连续的膜,正常的嵴和电 子致密度;皮质颗粒大量减少,仅在有质膜完整的卵母细胞中零星的散布,基质出现空白区,有的区域有絮 状物聚集,脂滴形态基本维持完整. 3讨论 3.1冷冻对猪卵母细胞的生物学形态和受精的影响 在本实验中,尽管玻璃化冷冻解冻后的卵母细胞从形态看有39.94%是存活的,但体外卵裂率仅为 21.67%,说明经过冷冻处理,导致部分的卵母细胞形态学结构变化,发育潜力严重受损,降低了卵母细胞的 受精能-0.引起卵母细胞受精后卵裂率降低的原因较多,其一是由于冷冻保护剂浓度较大,对细胞的毒害 作用也随之增大;其二是冷冻解冻过程中,温度的骤变(降温和升温)使卵母细胞不同程度地受物理性的损 伤导致透明带破裂而造成死亡.其三是解冻后除防冻剂过程中渗透压变化对卵母 细胞的损伤.在本实验 中,卵母细胞是在O.5mol?L蔗糖溶液中二步脱除防冻剂.可能稀释的速度过快,在稀释过程中渗透压降 低的速率超过了卵母细胞能承受的最大限度而引起卵母细胞的损伤. 3.2冷冻对猪卯母细胞微绒毛的损伤 冷冻保护剂的渗透效应及化学毒性都能引起质膜的损伤,平衡过程中由于渗透压的差异,水及冷冻保 护剂快速通过质膜引起质膜的破裂.尤其是玻璃化溶液的化学毒性是造成质膜的破坏的主要原因.猪卵母 细胞中除含有大量的脂滴外,还含有大量被称为"卵黄球"的囊泡,在本实验中脂滴从形态上看保存较好, 而脱除玻璃化溶液后,囊泡发生变形融合,并迁移细胞质周围,致使质膜模糊,破裂,微绒毛消失.这一特点 与Schmidt等(1995)采用10%甘油对体外成熟的牛卵母细胞进行程序化冷冻后的囊泡的超微结构变化框 l24上海交通大学(农业科学版) 图版Plate 第24卷 第1期朱淑文,等:玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响125 ? 图版说明ExplanationofPlates 1.成熟卵母细胞电镜照片箭头示完整的质膜 (Electronmicrographfromuntreatedcontroloocyte,arrowshowingintactplasmamembran e)x3500 2.成熟卵母细胞胞质中单个散布的囊泡 (Vesicleslocatedsolitarilyintlleooplasmofuntreatedcontroloocyte)x3000 3成熟卵母细胞中脂滴,囊泡和线粒体相邻分布 (Lipiddroplets,vesiclesscatteredintimatelyrelatedtomitoehondriainuntreatedcontrolooc yte)×6Oo0 4.10%Ee+10%DMS0处理的卵母细胞中透明带和质膜断裂.箭头示断裂处 Zonapellueidaandoolemmacrackof10%EG+10%DMS0-exposedoocyte.arrows)x6000 5.玻璃化液处理的卵母细胞中线粒体电子致密度降低,箭头示电子致密度降低 itochondriawithreducedmatrixdensityofEDFS40exposedooe~-te,arrows)x8000 6.玻璃化液处理后的完整的卵母细胞 (IntegrityofeelorgancllesofEDFS40-exposedoocyte)x6000 7.玻璃化液处理后质膜模糊 (indistinctionaloolemmaofEDFS40.exposedoocyte1xl0Oo0 8.玻璃化液处理后囊泡融合,异常与正常的线粒体同时存在 (Vesiclesbecameconfluent,normalandabnormalmitochondriacoexistofEDFS40-exposedoocyte)x8000 9.玻璃化液处理后囊泡融合迁移至细胞质周围及异常的脂滴 (ConfluentvesicleslocatedintheperipheryoftheooplasmandabnormallipiddropletofEDFS40-exposedoocyte)x5000 10.玻璃化液处理后细胞基质出现空白区() (DisorganizationofthematrixofEDFS40-exposedoocyte,arrow)xl0000 l1.玻璃化液处理后形态完整的脂滴 (IntactlipiddropletsofEDFS40-exposedoocyte)x5000 12.冷冻后质膜破裂,微绒毛,卵周隙消失,囊泡融合迁移至细胞质周围 (Thep1asmamembraneisbroken,microvilliandPVSdisappear,vesiclesarelocatedintheperipheryoftheooplasmoffrozen/ thawedoocyte)x8000 13.冷冻后正常与异常的线粒体同时存在 (Normalandabnormalmitochondriacoexistoffrozen/thawedoocyte)xl2000 14.冷冻后正常的线粒体,连续的膜,正常的电子致密度,嵴清晰可见 (Intactmitochondriawithcontinuousmembl~ne,normalmatrixdensityandobviouscfistaeoffrozen/thawedoocyte)x20000 15.冷冻后少量的皮质颗粒(A) (Fewercortica]granulesf?)offrozen/thawedoocyte)xl0000 16.冷冻后细胞基质空白区(守) (DisorganizationofthemaK(岔)offrozerdthawedooeyte)~5000 17.冷冻后囊泡融合 (Thevesiclesbecomeconfluenceoffrozen/thawedoocyte)x15000 同【41.由于在冷冻剂处理和脱除过程中,细胞收缩及膨胀的机械作用造成部分质膜的破裂和微绒毛的消失, 而玻璃化冷冻后的卵母细胞微绒毛几乎消失.微绒毛的消失,受精时,精子质膜不与卵质膜融合,造成受精 率下降?. 126上海交通大学(农业科学版)第24卷 3.3冷冻对卵母细胞皮质颗粒的影响 皮质颗粒是卵母细胞所特有的一种细胞器,它在保证单精受精及胚胎正常发育中起着重要作用.皮质 颗粒的大量增殖外迁并沿质膜线形排列是卵母细胞胞质充分成熟的一个重要标志,这种排列形式为精子 入卵后迅速发生的皮质反应和透明带反应创造了良好的条件川.皮质的重要性还表现在具有选择性的通透 性,以调节卵母细胞与周围环境的相互作用.而在冷冻解冻后的卵母细胞中很少见到皮质颗粒,可能是冷 冻剂的处理和低温造成皮质颗粒提前释放,这与Myers等【8]报道的由于冷冻保护剂中渗透压的作用导致皮 质颗粒发生胞吐作用及质膜的破损基本一致. 3.4冷冻对卵母细胞线粒体的影响 有实验证明,体外培养后,线粒体的嵴可以再生,因此线粒体的损伤对卵母细胞的发育成熟并不是致 命的唧.研究证明,猪卵母细胞经冷冻后对线粒体的损伤并不严重,只有少部分线粒体电子致密度下降,体 积膨大和嵴消失.显示,平皿一玻璃化冷冻猪卵母细胞对线粒体损伤较轻. 3.5冷冻对透明带的影响 透明带在精卵识别,结合和穿透的过程中以及阻止多精入卵和保护着床前胚胎方面,都起着至关重要 的作用.冷冻解冻过程中透明带的变化将影响卵母细胞的受精,Carroll等使用透明带穿孔技术发现冷冻解 冻后的小鼠卵母细胞受精率的下降是由透明带的变化引起的l101,Fuku钮n】的玻璃化冷冻牛卵母细胞实验 中发现冷冻解冻后透明带电子致密度加深,而在本研究中未观察到此变化,认为猪卵母细胞玻璃化冷冻引 起透明带的变化是否与皮质颗粒有关有待进一步研究. 3.6冷冻对卵母细胞质膜的影响 质膜在细胞生活中起着重要作用,因为细胞与环境发生的一切联系和反应,都必须通过质膜来实现. 卵母细胞膜还参与受精时精卵质膜的融合.因此,卵母细胞膜一旦受损,即使是很小的破坏.对其发育也是 致命的,它使卵母细胞受精能力丧失. 玻璃化冷冻后猪卵母细胞损伤的超微结构显示猪卵母细胞对冷冻非常敏感.玻璃化冷冻后卵母细胞 与未冷冻的相比,它失去了完整的细胞结构.冷冻解冻后最大的结构变化为,囊泡迁移至质膜处,并大面积 融合,使质膜空泡化,这一特点在冷冻牛和马的卵母细胞中也有见[12].人超排后的卵母细胞用DMSO和丙 二醇处理,也会呈现出空泡位于质膜周围【l3].卵母细胞中的囊泡含有脂质小体,在冷冻解冻过程中变形融 合.此变化可能发生在卵母细胞解冻后的稀释过程中,水分过多的渗入细胞内部,导致细胞膨胀.这一结构 的损伤同时也出现在经玻璃化溶液处理而未冷冻的卵母细胞中. 综上所述,平皿一微滴法玻璃化冷冻能引起猪体外成熟卵母细胞超微结构的改变, 主要表现在透明带 断裂,质膜变化,微绒毛消失和皮脂颗粒大量减少,以上原因导致了卵母细胞解冻后存活力下降和受精后 卵裂率降低,该玻璃化冷冻对体外成熟的猪卵母细胞的线粒体损害较轻. 参考文献 [1]1王果,马燕琳,吕祁峰,等.平皿—微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎[J].湖南医科大学,2002,27(4):299-301. 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