BNIP家族蛋白与凋亡和自噬及其与疾病的关系

BNIP家族蛋白与凋亡和自噬及其与疾病的关系 BNIP 家族蛋白与凋亡和自噬及其与疾病的 关系 董子洵，杨宝学 5 (北京大学医学部基础医学院药理学系，北京 100191) 摘要:BNIP 家族蛋白是 bcl-2 家族中“BH3-only”亚家族的成员，属于促凋亡蛋白。BNIP1 在维持线粒体和内质网结构和功能上发挥重要作用。BNIP2 的 BCH 结构域在形态发生、细 胞生长、分化和凋亡中起到关键作用。BNIP3 通过 MPTP 开放引发坏死、线粒体凋亡和自 噬诱导细胞死亡，并与肿瘤的迁移，预后和一些心血管疾病的发病密切相关。BNIP 家族蛋 白可能成为肿瘤，心血管疾病研究的靶蛋白，并在未来的治疗中发挥重要作用。 10 关键词:肿瘤;心血管疾病;BNIP 蛋白;线粒体;细胞死亡 中图分类号:A The functions of BNIPs in apoptosis and autophagy and their roles in cancer and cardiovascular diseases 15 DONG Zixun, YANG Baoxue (Department of pharmacology, School of Basic Medical Sciences,Peking University Health Science Center, Beijing 100191) Abstract: BNIP family proteins belong to a group of proteins in Bcl-2 family which named “BH3-only” proteins. BNIP1 is pro-apoptotic and have remarkable effects on maintain 20 mitochondria and ER structures as well as their functions. The BCH domains of BNIP2 regulate multiple signaling pathways, leading to cell growth, apoptosis, morphogenesis, migration and differentiation. BNIP3 induces necrosis, apoptosis and autophagy. Consistent with their ability to induce cell death, BNIP3 is implicated in the pathogenesis of cancer and heart disease. BNIP family proteins may become a target of cancer and cardiovascular disease’s treatment. 25 Keywords: cancer; cardiovascular disease; BNIP proteins; mitochondria; cell death 0 引言 细胞死亡主要通过两种形式:细胞凋亡和坏死。而自噬被认为是细胞死亡的第三种形式。 自噬是通过溶酶体系统消化自身细胞器或大分子产生能量的代谢过程。自噬与细胞生长，分 30 化及维胞内稳态等过程密切相关。在长时间营养饥饿的状态下，细胞也会消化自身的重要物 质从而进入“自噬相关的细胞死亡”[1]。上述细胞死亡途径都与维持细胞生存的重要细胞器 ——线粒体密切相关。许多线粒体相关的对细胞存活与死亡起调控作用的蛋白已经被发现。 1 综述 1.1 BNIP 蛋白家族简述 35 bcl-2 家族是参与细胞凋亡的重要家族之一，与线粒体的渗透性和稳定性的调控相关， 其家族成员的蛋白结构至少包含 4 个 bcl-2 同源结构域(BH1~BH4)中的一个。Bcl-2 家族 蛋白按功能主要分为诱导凋亡和抑制凋亡两大类，其 BH1~BH4 结构域的不同组合决定了其 基金项目:国家重大新药创制科技专项(2009ZX09103);国家自然科学基金资助项目(No.30870921， 81261160507 和 81170632);科技部国际科技合作与交流专项(No. 2012DFA11070);教育部博士点基金资 助项目(No.20100001110047)。 作者简介:董子洵，(1987-)，男，博士研究生，膜通道药理学。 通信联系人:杨宝学，(1962-)，男，教授，膜通道药理学。E-mail: baoxue@bjmu.edu.cn -1- 诱导或是抑制凋亡的功能。Bcl-2 家族的蛋白都具有 BH3 结构域，其抗凋亡亚家族 bcl-2， 40 bcl-xl，bcl-w，MCL-1 等蛋白同时有 BH1~4 所有结构域，;而促凋亡亚家族 BAX 和 bak 含 [2,3]。BNIP 家族蛋白 有 BH1 到 BH3 结构域，Bid，Bad，BNIPs 等蛋白仅含有 BH3 结构域 (Bcl-2/adenovirus E1B 19kD protein interacting proteins)是由 Boyd 等于 1994 年利用酵母双杂 交技术发现并命名的能与腺病毒 E1B 19kD 蛋白相互作用的一类蛋白质，主要分为 BNIP1, 2, 3 三个成员，定位于细胞核膜、内质网膜和线粒体膜上[4]。在维持膜稳定性，参与线粒体凋 亡，自噬等途径中起重要作用。BNIP 类蛋白属于 bcl-2 蛋白家族中仅含有 BH3 结构域的蛋 45 。BH3 结构域可 白亚类，其发挥功能的结构主要是 BH3 结构域和羧基末端跨膜结构域 TM 与 bcl-2，bcl-xl 结合形成异二聚体从而抑制后者的抗凋亡功能，而 TM 结构域也具有同源聚 合，线粒体锚定等功能，并可介导非 caspases 依赖性线粒体凋亡途径[5]。BNIP 类蛋白在调 控线粒体渗透性发挥重要作用，和细胞凋亡，坏死和自噬密切相关。 50 1.1.1 BNIP1 BNIP1 具有 228 个氨基酸，其与 BNIP2 一起主要定位于内质网和核膜上，在脑，心脏， 胎盘，肺，骨骼肌和肾脏中皆有 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。Zhang 等分离出 BNIP1 蛋白的三种剪切体 BNIP1-a， BNIP1-b，BNIP1-c，其中 BNIP1 和 BNIP1-b 具有完整保守的 BH3 结构域，而 BNIP1-a 和 BNIP1-c 则不具有，但 BH3 结构域缺失的这两种剪切体也可与 bcl-2 结合，提示 BNIP1 与 55 bcl-2 等 bcl-2 家族抗凋亡蛋白的结合可能是非 BH3 结构域依赖的。尽管如此，BH3 结构域 仍然是 BNIP1 发挥其促凋亡作用所必需的，缺失了 BH3 结构域的 BNIP1-，和 BNIP1-c 不会 [6,7]。 引起细胞死亡 BNIP1 对维持内质网膜稳定，内质网融合功能上发挥重要作用。BNIP1 是突触融合蛋白 18，一种内质网定位的可溶性 N 乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)连接蛋白(SNAP)受体 (SNARE)的组成部分。BNIP1 参与形成内质网网络结构，其 BH3 结构域不仅参与凋亡过 60 程，还能与，-SNAP 结合调节内质网的融合和结构形成。反之，，-SNAP 的过表达抑制了十 字胞碱引发的细胞凋亡，可能是由于，-SNAP 抑制了 BNIP1 的 BH3 区与抑凋亡分子的结合。 BNIP1 在凋亡与内质网膜融合之间可能发挥联系作用[8]。近期研究发现 BNIP1 也参与自噬 的调控，BNIP1 可以和线粒体 E3 泛素连接酶 RNF185 结合，并在 RNF185 的作用下发生多 聚泛素化，从而募集既能与泛素结合又能与 LC3 结合的自噬受体 p62，提示 BNIP1 在泛素 65 化与自噬之间发挥桥梁作用[9]。BNIP1 有关研究相对较少，其在正常和病理状态下的作用有 待进一步研究。 1.1.2 BNIP2 BNIP2 有 315 个氨基酸，在细胞中的定位与 BNIP1 基本相同，表达部位也基本一致， 70 在骨骼肌，子宫，心脏，肺，血管平滑肌等多个组织均有表达。BNIP2 包含一个 Rho GTP 酶激活蛋白(GAP)同源区和一个钙离子结合区，提示 BNIP2 可能参与 GTP 酶介导的信号 传导途径和钙离子调控的细胞凋亡。尽管 BNIP2 并不具备 TM 结构域，但其与 BNIP1 一样 可在内质网膜和核膜上与抗凋亡蛋白 bcl-2 结合发挥其促凋亡作用。BNIP2 是成纤维细胞生 长因子(FGF)酪氨酸激酶的底物，并介导对 GTPase Cdc42 激活的活性。BNIP2 的 C 端与 Cdc42GAP 的非催化区序列高度同源，并因此命名为 BCH(BNIP2 and Cdc42GAP homology) 75 区[10,11]。 BNIP2 和 Cdc42 可以通过 BCH 结构域形成同型二聚体或异二聚体。尽管缺少与 GTPase 激活蛋白催化区的同源性，BNIP2 的 BCH 结构域与 Cdc42 结合通过精氨酸富集的结构域激 -2- 发 GTPase 活性。进一步通过分子重建和缺失突变表明第 217 位到第 221 位氨基酸序列 80 RRKMP 为 BNIP2 主要的 BCH 相互作用的区域，而激活 GAP 活性必须的精氨酸富集结构 域第 235 位到第 239 位氨基酸序列 RRLRK 和 Cdc42 结合区第 288 位到第 230 位氨基酸序列 [12]。结果表明 BCH 结构域间的相互作用是 EYV 的缺失均不影响 BCH 结构域间的相互作用 一种由特殊的蛋白间相互作用结构域介导的。BNIP-S 基因编码两种异构体，BNIP-S，和 BNIP-Sβ。BNIP-S，具有完整的 BCH 结构域，而 BNIP-Sβ的 BCH 结构域缺失，取代其位 置的是一段无意义序列。两种异构体都广泛地表达在不同的组织和细胞中，但只有表达 85 BNIP-S，才会出现明显的凋亡现象。BNIP-S，可以通过其 BCH 结构域中的特殊序列形成亲 同种抗原的复合物，而这段序列的缺失会抑制其促凋亡功能，说明 BCH 结构域具有介导凋 亡功能[13]。除此之外，BCH 结构域还可以在神经元和肌元性分化中充当脚手架作用，与 Cdo 受体结合并激活 Cdc42，从而激活 JLP/P38 MAPK 通路 [14,15]。 BNIP-2 在体外可以被 Caspase3,6,8,10 剪切，在细胞系中也受到 Caspase3,8,9 的影响，也有研究证实 BNIP2 也可以 90 被粒酶 B(granzyme B)清除，而 Caspases 和粒酶 B 的清除作用可能导致细胞凋亡性的包含 BCH 的片段释放[16,17]。 1.1.3 BNIP3 BNIP3 是 BNIP 家族研究最多的成员，编码 194 个氨基酸，分子量为 21kD。BNIP3 在 95 人类几乎所有的组织和细胞中都有表达,在正常生理条件下，BNIP3 在肝，肾，肺，骨骼肌 等多种正常组织中均有较低水平的表达，而在脑，心，睾丸等组织呈高水平表达。 BNIP3 含有多个结构域，其中除了介导凋亡的两个结构域 BH3 和 TM 外，还有氨基端结构域(NH2), 与 BH3 结构域有类似的功能，而位于 54-81 位氨基酸的 PEST 结构域富含脯氨酸，谷氨酸， 丝氨酸和苏氨酸，主要参与蛋白质的降解。正常生理条件下，BNIP3 大都定位于细胞质线粒 体外膜上，但在脑等少数组织中其表达定位于细胞核，在缺氧诱导等条件刺激下 BNIP3 的 100 [18]。 表达由胞核转位至胞质而行使其促凋亡功能 HIF1 是缺氧诱导的细胞凋亡信号中具有重要调控功能的一种核转录因子。正常情况下， VHL 蛋白可识别 HIF1 的氧依赖结构域，使得 HIF1 被胞内的蛋白酶体降解;低氧状态下， VHL 蛋白丧失对 HIF1 的识别功能，造成 HIF1 的累积。在缺氧状态下，HIF1 与 HRE 发生 紧密结合，从而特异性调控包含缺氧反应元件 HRE(hypoxic-response element)的启动子下 105 游基因的表达。BNIP3 的转录起始位点上包含 2 个 HRE，是 HIF1 的下游靶基因。对多种肿 瘤细胞的研究表明，在缺氧条件下，HIF1 可诱导 BNIP3 高度聚集以启动凋亡和稳定 p53[19,20]。 Bcl2 家族蛋白在细胞死亡的调控中发挥重要作用，作为 bcl2 家族促线粒体凋亡蛋白， BNIP3 的 TM 结构域，BH3 结构域等几个重要结构域分别参与不同死亡途径。 BNIP3 可以介导非凋亡性的细胞死亡。Vande Velde 等发现在 293T 细胞中过表达 110 BNIP3，并在缺失 apaf1，caspase3，caspase9 和没有细胞色素 C 释放的情况下可引起 293T 细胞死亡，这种死亡是坏死性的[21]。正常情况下，BNIP3 通过 TM 结构域形成二聚体并散 在分布在线粒体外膜表面，当细胞接受外来凋亡信号或导入外源性 BNIP3 时，BNIP3 与线 粒体外膜紧密结合并打开 MPTP(Mitochondrial Permeability Transition Pore)，MPTP 是线粒体 内，外膜连接位点之间一种假想的具有高度调节性的离子通道。MPTP 处于开放状态时，允 115 许 1.5 kD 的可溶性物质自由通过，导致线粒体去极化，质子电化学梯度下降，继而出现呼 吸抑制，活性氧产生增加，伴随染色体浓集和 DNA 断裂。该凋亡过程可以被 MPTP 抑制剂 阻断，而 caspases 抑制剂则无法抑制其凋亡过程。因此，BNIP3 可以介导非 caspases 依赖性 -3- 的线粒体凋亡途径。BNIP3 的 TM 结构域突变使其不能形成二聚体但仍可以保持线粒体膜上 120 的锚定功能，结果仍可以引起细胞死亡，表明形成同源二聚体不是履行 BNIP3 功能所必需 [22,23]。 的 凋亡是维持组织稳态、发育、清除受感染和损伤细胞的一种调节方式。和经典的 BH3-only 分子一样，BNIP3 中的 BH3 结构域与抗凋亡分子 Bcl2 和 Bcl-xl 形成异二聚体，进 一步使得 Bax 和 Bak 游离并活化，促使线粒体释放细胞色素 C，活化 caspase9 依赖的细胞 情况下，BNIP3 不能单独启动 caspase 依赖性的线粒体 凋亡通路。在细胞内缺失 Bax，Bak125 凋亡途径[24]。而与经典的 BH3-only 蛋白不同，caspase 依赖性的线粒体凋亡途径并不是 BNIP3 引起细胞死亡的主要途径。经典的 BH3-only 蛋白介导细胞死亡只通过 caspase 依赖性线粒体 凋亡途径而不引起 MPTP 途径的变化，而 BNIP3 引发的细胞死亡很难独立于 MPTP 的开放; 经典的 BH3-only 蛋白高度依赖于其 BH3 结构域的功能，而 BNIP3 的功能发挥更多的决定 于其 TM 结构域;经典的 BH3-only 蛋白引发凋亡性细胞死亡，而 BNIP3 引发的细胞死亡原 130 因则更为复杂，坏死为此类细胞死亡表现出的主要特性，但也有其他原因参与其中，如凋亡， 自噬等[25,26]。尽管在 BNIP3 分子中 BH3 结构域并非其诱导细胞死亡的必要条件，但 BH3 结构域在 BNIP3 所介导的 caspase 依赖性线粒体凋亡途径起主导作用 。 Daido 等首先在神经酰胺介导的恶性神经胶质瘤自噬性死亡中检测到了 BNIP3 的上调， 上调的 BNIP3 导致线粒体去极化而导致自噬[27]。Kanzawa 等将三氧化二砷运用到恶性胶质 135 瘤的研究中，结果发现三氧化二砷能够上调 BNIP3 的表达，导致肿瘤细胞产生由 BNIP3 介 导的自噬性细胞死亡[28]。表达 BNIP3 的 HEK293 细胞在电子显微成像中表现出染色体固缩， 线粒体肿胀和胞浆空泡等坏死性细胞死亡特征。过表达 BNIP3 也会表现出自噬性细胞死亡 的特征，电镜下表现为自噬样空泡出现，自噬膜结构上标志蛋白 LC3 增加和膜定位。BNIP3 敲降能阻滞缺氧引发的自噬和细胞死亡，但不能阻止 LC3 在自噬体上的定位，提示 BNIP3 140 可能与自噬体，溶酶体融合相关[29]。也有研究表明 BNIP3 敲降可以抑制 LC3-I 到 LC3-II 的 转化，进而阻止细胞自噬性死亡。BNIP3 引发自噬的机制还不非常清楚，已有的研究结果可 归结为 2 种假设:一是 BNIP3 与 Bcl2 的结合，正常情况下 Bcl2 与 Beclin1 结合并阻止 Beclin1 游离，而 BNIP3 可与 Bcl2 结合，使 Beclin1 游离，发挥其诱导自噬的作用;二是 BNIP3 通 过与 mTOR 的激动剂 Rheb 结合，进而抑制 mTOR 信号通路，促进自噬发生[30]。有关 BNIP3 145 引发自噬的分子机制有待进一步研究。 1.2 BNIP 与肿瘤 肿瘤细胞具有高增殖和高存活的特性。肿瘤细胞的一些非正常表型会诱导凋亡通路。而 为存活，细胞会为逃逸凋亡信号作改变，其中一种方式是提升抗凋亡 Bcl2 家族蛋白的表达。 抗凋亡 Bcl2 家族蛋白通过其疏水结构裂隙与前凋亡蛋白(Bax，Bak)的 BH3 区域形成异二 150 聚体而阻止其诱导下游通路。而 BH3-only 蛋白利用其 BH3 结构域与抗凋亡 Bcl2 家族蛋白 相结合，使得前凋亡蛋白游离并激活下游通路从而行使其诱导凋亡功能[31]。所以 BH3-only 家族蛋白常作为考察肿瘤状况的指标，常见的分子有 PUMA，NOXA，Bim 等，而 BNIPs 也作为相应指标，其中 BNIP3 由于具有缺氧诱导结构域 HRE 可被 HIF1 调控而被单独研究， 而 BNIP1 和 BNIP2 与肿瘤相关的单独研究则相对较少。 155 实体瘤在其发生发展过程中往往伴随不同程度的缺氧缺血，在氧合不足区域，缺氧以凋 亡形式杀死肿瘤细胞的同时引起肿瘤细胞内部血管新生，细胞增殖因子异常等表现，提高肿 瘤细胞的突变率，使得肿瘤细胞可以抵抗化疗，最终导致肿瘤浸润转移和耐药现象。BNIP3 -4- 在各肿瘤中表达情况不一，可以发生表达上调或下调。另外，BNIP3 在不同肿瘤中的定位也 160 有差异，有些定位在胞核而有些在胞浆[32,33]。关于肿瘤中 BNIP3 表达调控，定位和功能不 同存在多种机制。 1.2.1 BNIP 上调与肿瘤 BNIP3 在原发前列腺癌，肺癌等许多肿瘤中表达上调。而这些 BNIP3 上调的肿瘤中 BNIP3 表达水平的上调程度往往与肿瘤的病程呈正相关。在原位导管腺癌中 BNIP3 表达水 165 平的上升伴随着增殖等级的上升和侵袭度的上升。在肺癌，脑室膜瘤等肿瘤中 BNIP3 表达 的上调表明病人的预后较差。在过表达 p53 的肺癌细胞系中 BNIP3 发生上调，在高转移能 [34,35]。这些数据似乎使我们对 BNIP3 功能的理解有一些迷惑，BNIP3 力的细胞中更加明显 过表达通常会引起细胞死亡，但在一些肿瘤中 BNIP3 的过表达提示肿瘤细胞具有更强的侵 袭能力与更差的预后。研究发现，BNIP3 在肿瘤细胞的定位对 BNIP3 发挥功能发挥决定性 作用。在胶质细胞瘤等肿瘤中都观察到 BNIP3 的核定位，而阻断 BNIP3 定位于线粒体并行 170 使其促凋亡功能可能是这些肿瘤的表型与通常 BNIP3 功能矛盾的原因之一[36]。 BNIP 下调与肿瘤 1.2.2 Murai 等在对胃，结直肠癌和造血系统肿瘤细胞株或组织的研究中发现，14/24 的胃、 结直肠癌细胞株,66%结直肠癌组织,49%胃癌组织,6 种造血系统肿瘤细胞株和超过 80%的造 175 血系统肿瘤组织均缺乏 BNIP 表达[37]。研究者采用表观遗传学方法在多种肿瘤中发现 BNIP3 基因处于沉默，通常表现为其启动子甲基化和组蛋白去乙酰化。BNIP3 的低水平表达使肿瘤 细胞不能进入死亡途径，使其产生化疗抗性，并降低病人的存活率。在绝大部分胰腺癌中， BNIP3 表达下调，且和预后不良有关，缺氧刺激亦不能诱导 BNIP3 表达，原因在于 BNIP3 启动子位于 CpG 岛，在大部分胰腺癌细胞中甲基化。甲基化被认为是阻止抑癌基因表达的 一种途径，运用甲基化抑制剂 5-氮-2-脱氧胞苷可恢复 BNIP3 的表达，诱导死亡。胰腺癌， 180 结肠癌和胃癌病人的正常组织中并未检测到 BNIP3 启动子的甲基化，表明 BNIP3 的甲基化 是肿瘤细胞所特有的[38,39,40]。肿瘤组织细胞中对抗抗凋亡因子作用的重要分子，在多种肿瘤 表达都受到抑制的 BNIP3 使得肿瘤细胞得以存活，但具体机制仍需要进一步的研究。 1.3 BNIP 与心血管疾病 由于 BNIP 家族蛋白定位于线粒体，而心肌细胞中的线粒体是为心肌细胞提供心肌收缩 185 能量的主要来源。BNIP 蛋白对线粒体膜的通透性，结构完整性和线粒体凋亡途径有至关重 要的作用。在缺血状态下，心肌细胞得不到足够的营养和能量，长期缺血的心肌细胞和血管 细胞表现出凋亡和坏死的病理特征。心肌细胞在缺血再灌注损伤等病理状态下的致病因素主 要是缺氧和酸中毒。缺氧是组织中缺少血液流动的必然结果，而酸中毒则大都是由于缺氧引 起的糖酵解和乳酸生成增加等一系列代偿性结果。缺氧对 BNIP3 的调节主要发生在转录水 190 平，通过缺氧诱导因子 HIF-1 作用于 BNIP3 启动子区域的缺氧反应元件(HRE)实现，长期缺 氧时 BNIP3 的表达上调，导致心肌损伤。细胞缺氧可有 BNIP3 聚集，伴酸中毒时激活 BNIP3， 促进其线粒体定位和促凋亡功能的发挥，导致细胞死亡。但无酸中毒则细胞不发生死亡，缺 氧和酸中毒共同作用于 BNIP3 促进心肌细胞死亡。研究发现 BNIP3 可以介导缺氧，酸中毒 引发的心肌细胞死亡。BNIP3 在大鼠心肌细胞缺血过程中表达显著增加，并在再灌注过程中 195 持续高水平表达。另外在多种动物心力衰竭的模型中都能检测到高水平的 BNIP3 表达。这 些研究都 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 BNIP3 在心血管疾病中发挥重要的作用[41,42]。 -5- 2 展望 BNIP 家族蛋白是 Bcl2 蛋白超家族中的促凋亡成员，只具有 BH3 结构域，故与 Bim， 200 PUMA 等分子同属于“BH3-only”促凋亡亚家族，主要通过线粒体行使其分子功能。关于 BNIP1 的研究相对较少，但已有研究结果表明 BNIP1 在维持线粒体和内质网形态和功能上 发挥不可或缺的作用，其它功能与作用机制需要进一步研究。BNIP2 除了 BH3 结构域的作 用外，BCH 结构域可与 Cdc42 等多种重要蛋白结合，调节 p38MAPK 等重要信号传导通路， 在形态发生、细胞生长、分化和凋亡中发挥了复杂且多样的调控作用。BNIP3 尽管在生物功 能和作用机制上的研究较为全面，并在肿瘤和心血管疾病的研究中作为标志性分子之一初步 205 阐述了其与疾病间的联系，但仍有很多问题仍未明确，例如 BNIP3 的异常表达和肿瘤的进 展及转移有关，具体的分子机制仍不清楚，还有待深入探讨。在 BNIP3 表达发生改变的疾 病中，其它 BNIP 蛋白的变化尚不清楚，作为同一亚家族的蛋白，其它 BNIP 蛋白与这些疾 病间的关系也值得深入研究。同样，其它 BNIP 蛋白的信号转导功能研究也在初步阶段，阐 明 BNIP 家族蛋白在信号传导途径中的功能会对我们了解其在疾病发生时，细胞死亡过程中 210 所扮演的角色有更加深入的理解。尽管还有许多关键性问题未得到解决，但 BNIP 家族蛋白 有可能成为研究肿瘤，心血管疾病等重大疾病的靶向分子，并在这些疾病未来的治疗中发挥 重要作用。 [参考文献] (References) 215 [1] 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