RACE技术-引物设计
基因特异性引物(GSPs)应该是:
,28nt 1、23
2、50,70,GC
3、Tm值?65度，Tm值?70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
8、引物GSP中的GC含量要在50,70,之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。
9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100,200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。
11、验证基因特异性引物的对照:
单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实
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达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5,12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。
需要声明的一点是，做RACE的引物与扩增已知序列的引物设计有所不同，5’RACE的GSP和NP
引物为cDNA上的序列，3’RACE的GSP和NP引物为与cDNA反向互补的序列。用软件或经验公式
提供的退火温度只是一个参考值，在具体操作中要灵活多变。
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