一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法

简 手及 第 4 5 卷 第 1。 期 2 0 0 0 年 1 0 月 科 考五 叙 一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒 载体的方法 吴 小兵 ¹ 董 小岩 ¹ 伍志 坚 ¹ 屈建 国º 侯云德 ¹ (中国预防医学科学院病毒学研究所¹ 病毒基因工程国家重点实验室 ; º形态室 , 北京 100 0 52 . * E m a il: w u x b @ Pu b lie 毛a st . e n , n e t) 摘要 利用 2 型腺病毒伴随病毒(ad e n o 一 a s s o e ia te d v iru s typ e Z , A A v 一2)能够抵抗氯仿的特性 , 采用 “氯仿处理一PE G /N a CI 沉淀一氯仿抽提” 3 个步骤分离 、浓缩和纯化重组腺病毒伴随病毒(r ec o m bi na nt ad e n o 一a s s o c ia te d v ir u s , r A A V ) , 整个纯化过程可在 4 h 内完成 . 最终从 5 个转瓶生长的 4 x 10 9个载 体生产细胞 中可得到 5 x 10 ,’ 病毒颗粒/m L , s D s 一聚丙烯酸胺凝胶结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 , rA A v 的纯度大于 9 5% , 电子显微镜下绝大多数病毒颗粒的结构完整 . 纯化后的 : A A V 仍保持较强的感染性, 其感染 性滴度达到 Z X ro ” 转导单位(tr an ed uc in g u ni t , T u )/ m L , 总的病毒颗粒数与感染性病毒颗粒数的 比值为 2 5 . 为 rA A V 大规模生产后的纯化提供了一种简便 、 快速 、 低成本的方法 . 关键词 重组腺病毒伴随病毒 氮仿 纯化 由 2 型腺病毒伴随病毒 (A A V 一2) 改造而来的重组腺病毒伴随病毒(r A A V )是一种安全 、 有效 的基因转移载体 , 已用于多种人类疾病的基因治疗研究 . 然而长期以来 , 大量 、高纯度的 : A AV 一直难以获得 , 使其应用受到了限制 . 近两年来 , rA A V 的大规模制备策略有了突破性进展 . 伍 志坚和 c o n w ay 等人L’, 2}先后构建了具有 : A Av 包装功能的重组 1型单纯疙疹病毒 (r ec o m hi na ni h e rp e s sim p le x v iru s ty p e l , r H SV 一 l ) , 以此感染携带 rAAV 前病毒的载体细胞株 , 可方便地实现 rA A V 的大规模生产 . 但是 , 在 rA A V 的纯化方面 目前仍然缺乏高效 、 简便 、 低成本的方法 . 常 规的方法是采用硫酸钱浓缩 、 氯化艳密度梯度离心进行纯化l3] , 这种方法费时 、 步骤繁琐 、 回 收率低 . 由于已初步鉴定出硫酸乙 酞肝素蛋白多糖(heP 盯in s u lfat e p rot eo g lyc a n )是细胞膜上 AAv 一2 的受体 [4] , 特异性识别成熟 AAv 一2 毒粒的单克隆抗体也 已成功制备 [5] , 因此 , 利用肝素 亲和层析16, 7 〕或免疫亲和层析181 可以高效地纯化 rA A V ) 但这类方法费用较高 , 不易推广 . 本研 究充分利用了 A AV 一2 的外壳能够抵抗氯仿的性质 , 采用氯仿处理 一PE G/ N aCI 沉淀一氯仿抽提 3 个步骤 , 提供了一种快速 、 简便 、 高效地分离 、 浓缩和纯化 rA A V 的新方法 . 1 材料与方法 ( i ) 主要实验材料 . 含有绿色荧光蛋白( g r e e n n u o r e sc e n t p ro te in , G FP)基因的 r A蒯 载体 质粒 p SN AV 一G Fp 为我们课题组将 pG R E E N 一LA N T E R N (G IB C O /B R L )上的 e FP 基因插人 p sN脚 载体 l9] 的多克隆位点构建而成 (待发表资料 ) . H eL a 细胞购 自AT c c . B H 幻sGI 细胞为我们课题 组先前建立的含 G FP 基因表达盒的 A A V 载体细胞株 . 上述细胞均用含 10 %胎牛血清的 R PM I 164 0 培养液培养 . 具有 A AV 复制和包装功能的重组 1型单纯疙疹病毒—H S V I 一rc /△U L Z为我们先前重组产生 [’l, 在 B H K 一21 细胞上传代 、 扩增 . 用 于细胞大规模培养的转瓶( 110 m m x 480 m m )及转瓶机为 w hea ton 公司产品 . ( il ) 表达 G FP 的 rA A V (r A AV 一G FP) 的生产 . 将 B H 幻 SG I 细胞扩大培养后接种到 5 个转 瓶中 , 培养液体积为每个转瓶 200 m L . 细胞长满后 (共约 4 x l护个细胞 )将培养液倾出, 加 10 m L 207 1 拼 考 五 叙 第 4 5 卷 第 1。期 2 0 0 0 年 1 0 月 简 手及 辅助病毒 H S V 一re / 八 U L2( M 0 I = 0 . 1) , 低速转动吸附病毒 2 h . 每个转瓶加 2 00 m L 无血清 16 40 培养液 37 ℃低速转动培养 . 为避免纯化时体积过大 , 24 ~3 6 h 后 , 将每个转瓶中的液体弃去 10 0 m L 继续培养 24 科s h 直到细胞完全病变 、 容易脱落时 , 盖紧瓶盖剧烈振摇 , 将瓶壁上 的细胞全部 洗脱至培养液中 . 收集合并 5 个转瓶的培养物 . (i ) rA Av 的纯化 . 步骤见图 1 . 将收集的培养物定义为初始物 . 加人 1/ 10 体积的氯仿 , 置于 37 ℃摇床中剧烈振摇 l h , 加人固体氯化钠至终浓度 1 m ol /L , 振摇溶解 . 4 ℃ , 12 000 r/ m in 离心 巧 m in . 取出上层水相 , 弃去氯仿和沉淀 . 加 PE G S000 至终浓度 10 % (w / v) , 振摇溶解后 冰浴放置 l h , 11 000 r/ m in 离心 巧 m in . 将上清弃去 , 用 5 m L PB S2+ 缓冲液将各离心管管底和 管壁上的沉淀吹打洗脱下来合并 , 将其分装至 1 . 5 m L 塑料离心管中(0 . 6 m u 管), 此时的 rA Av 定义为中间产物 . 加人 D N a se 和 R N a se 至终浓度 1 “g zm L , 室温下消化 3 0 m in . 加等体积的氯 仿抽提 . 4 ℃ , 12 000 r/ m in 离心 5 m in , 在无菌操作下小心吸出上层水相 . 该液体即为浓缩和纯 化的 rA A V 一G FP病毒液 , 定义为终产物 . 总 回收率 = 终产物的感染性病毒颗粒数 /初始物的感 染性病毒颗粒数 . 收集的细胞及倍养液 步骤 l 杏 } , 仿处理 } { 加入 1/ 10 体积的抓仿 , 剧烈振摇 ; 加入固体 N aC I至终浓度为 1 m o lzL : 离心 , 收集上清 步骤 2 PE G /N a CI 沉淀 加入 PE G 8 0 0 0 至终浓度为 10 % (w / v ) ; 离心 , 去上清 ; 用少1 P B S 2+ 重悬沉淀 ; 加入 D N a se 至终浓度为 一卜gzm L 步骡 3 抓仿抽提 收集水相 (纯化的 rA A V ) 图 1 用三步法分离 、 浓缩 、 纯化 rA A刀 的示意图 (iv ) 用 S D S 一聚丙烯酞胺凝胶 (S D S 一PA G E) 检测 rA AV 的纯度 . 按文献 [9 ]方法灌制 SD S 一队G E 分离胶和积层胶 ,分离胶浓度为 ro % . 分别取纯化的病毒液和最后一步氯仿抽提前 的病毒液 2 0 林L , 加 Z x 加样缓冲液 20 “L , 沸水浴 3 m in . 每个加样孔加样 10 林L . 电泳完毕后 用考马斯亮蓝染色 , 用相应的脱色液脱色直到显 出低背景 、 清晰的条带 . (v ) rA A V 病毒的电子显微镜 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 . 纯化的 rA A V 一G FP经钨酸盐负染后 , 置于 150 目的镍 网上 , 电子显微镜观察 . (vi) rAAV 病毒物理滴度检测 . 用地高辛标记(B o e hin g er M a n n he in 试剂盒 )的 o FP探针点 杂交方法检测纯化的病毒液中 rAAV 一G FP 的物理滴度(病毒颗粒数/m L) . 将质粒 PS NAv 一G FP 准确定量 , 用稀释缓冲液以一 系列稀释度稀释后点到尼龙膜上 . 取 10 林L 纯化的病毒液用 20 72 简 手及 第 4 5 卷 第 1 9 期 2 0 0 0 年 1 0 月 拼 考 上 叙 与传统的氯化艳密度梯度离心方法相 比 , . 本方法快速 、 回收率高 , 同时不降低 rAAV 的感 染能力 . 与最近发展起来的几种柱层析方法相比 , 本方法成本低廉 , 在工艺上有 明显优势 . 用 本方法获得的 : A AV 可用于基因治疗的体外实验和动物实验 , 进一步纯化后可获得临床级的 A A V 产品 . 该方法适合于大规模分离和纯化 rA A V 病毒 , 并使其生产工艺化 , 尤其适用于以 H SV 病毒为辅助病毒产生的 rA AV 的纯化 , 也可用于无辅助病毒包装系统或无细胞体外包装 系统生产的 rA AV 的纯化 . 参 考 文 献 2 3 4 5 6 7 8 9 l0 伍志坚 , 吴小兵 , 侯云德 . 具有 A Av 载体包装功能的重组 H s V 的产生 . 科学通报 , 1 9 99 , 4 4 (5) : 5 0 6 ~ 5 09 C o n w ay J E , R hys C M J aP , Z o lo t uk hin l , e t al . H ig h 一 tit er re e o m b in a n t a d en o 一 a s s o e ia te d v ir u s Pr o d u e tio n u tiliz in g a r ee o m b in a n t h e rPe s sim Ple x v ir u s tyPe 1 v e eto r e x Pr e s sin g A A V 一 2 R eP a n d C aP . G e n e T h e r a Py , 19 9 9 , 6 : 9 8 6 一 9 9 3 Syn d e r R O , X ia o X , S a m u lsk i R J . P ro d u e tio n o f r ee o m b in a n t ad e n o 一 a sso e ia te d v ir a l v e et o r s . In : D r a eo Po li N , e d . C u r r en t p r o to c o ls in H u m a n G e n etie s . N ew Yo r k : J o h n W ile 扒 1 9 9 6 S u m m e rfo r d C , S a m u sk i R J . M em b r a n e 一 a s s o eia t ed h e Pa r a n s u lfa t e Pr o te o g lye a n 15 a r e e ePto r fo r hig h 一 tite r re e o m b in a n t a de n o 一 a s s o eia t ed v iru s tyPe 2 v ir io n s . J V ir o l , 19 9 8 , 7 2 : 14 3 8 ~ 14 4 5 W ist u b a A , K e rn A , W e g er S , e t a l . S u b ee llu la r e o m Pa r tm e n ta liz atio n o f a d e n o 一 as s o c ia ted v ir u s tyPe 2 v ir io n s . J V iro l , 19 9 7 7 1 : 1 34 1 ~ 13 5 2 C la r k K R , L iu X , M e G r a th J P, e t a l . H igh ly Pu rifi ed r e e o m b in a n t a d e n o 一 a s s o e ia te d viru s v e e to r s a r e b io lo g ie ally a c tiv e a n d fr e e o f d e te c tab le h e lPe r a n d w ild 一 tyPe v ir u s es . H u m G e n e T h er , 19 9 9 , 10 : ] 0 3 1一 10 3 9 Z o lo tu k hin S , B yrn e B , M a so n E , e t al . R e eo m b in an t ad e n o 一 asso e ia te d v ir u s Pu r ifi ea tio n u sin g n o v e l m e th o d s im Pr o v es infe etio u s tite r a n d yield . G e n e T h e r a p y , 19 9 9 , 6 : 9 7 3 一 9 8 5 G r im m D , K e r n A , R it tn e r K , e t al . N o v el to o ls fo r Pr o d u e tio n an d Pu r ifi e atio n o f re e o m b in a n t a d en o a sso c iated v iru s v e et o r s . H u m G e n e T h e r , 19 9 8 , 9 : 2 7 4 5 ~ 2 7 6 0 伍志坚 , 昊小兵 , 侯云德 . 系列腺病毒伴随病毒载体的构建及表达p 一半乳糖昔酶的研究 . 病毒学报 , 20 00 , 1 6( l) : l~6 S am b r o o k J , Fritseh E F, M a n iatis , e t al . M o lee u la r C lo n in g : A L ab o r a to ry M a n u a l . Zn d ed , N e w Yo r k : C o ld SPr in g H a r b o u r P re s s , 19 8 9 (2 0 0 0 一 0 3 一 0 9 收稿 , 2 0 0 0 一 0 6 一 19 收修改稿) 细胞外钙调素对转基因烟草悬浮细胞 rb 。S = G US 基因表达的促进作用 马力耕¹ º 周君莉º 张素巧º 刘 强 ¹ * 孙大业º * (¹ 清华大学生物膜和膜生物工程 国家重点实验室 , 北京 1000 84; º河北师范大学分子细胞生物学研究室 , 石家庄 05 00 16 * 联系人, E m a il: liu q @ m a il . ts in g h u a . e d u . e n , su n d y @ p u b lie sj , he . e n ) 摘要 以转 rb cs 一G US 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因的烟草悬浮培养细胞为材料 , 研究了细胞外钙调素对 rb cs 基因表 达的影响 . 实验证实培养介质中钙调素浓度与 rb cs 一 G US 基 因表达呈现一个在细胞培养初期较低 、 随后增高 、 然后再降低的动态变化 ; 而且培养介质 中钙调素浓度变化在前 , rb cs 一G Us 基因表达变 化在后 . 介质中加入外源纯化钙调素可以促进 rb cs 一G US 基因表达 , 而且这种促进作用具有浓度剂 量依赖性. 介质中加入不过膜 的大分子钙调素抑制剂 w 7 一ag aro se 抑制 rk cs 一 G US 基因表达 , 这种抑 20 7 5