反硝化聚磷菌的分离、纯化及鉴定—A2O缺氧段利用反硝化培养基进行分离、纯化及鉴定

反硝化聚磷菌的分离、纯化及鉴定—A2O缺氧段利用反硝化培养基进行分离、纯化及鉴定 1 前言 传统的生物脱氮除磷工艺是两个独立的过程。生物脱氮是有机氮氨化、硝化、反硝化及微生物的同化作用来完成的。其中反硝化作用也称脱氮作用由微生物在厌氧或微厌 [1]氧条件下将硝酸盐还原成氧化亚氮或氮气。而传统的除磷机理是聚磷菌在厌氧条件下，释放胞内聚磷形式贮存的磷酸盐，并吸收环境中的有机碳源将之以聚-β-羟基-链烷酯酸(PHA)的形式贮存在胞内;好氧条件下，聚磷菌以氧为电子受体，氧化细胞内贮存的 [2]PHA而产生能量，供其从环境中过量吸磷。传统的生物脱氮除磷工艺存在的弊端有:? COD氧化和硝化耗能巨大，且在COD氧化中失去了贮存在COD内的大量化学能，? 反硝化和生物除磷为两个独立的过程，且均需消耗COD，? 剩余污泥量大，? 耗 [3]能并造成大量的二氧化碳释放。 目前国内外开展了反硝化聚磷的研究，发现了一种兼性厌氧反硝化除磷细菌(DPB， -Denitrifying Phosphorus Removing Bacteria)，可以在缺氧条件下(无O，存在NO)，23以硝酸盐为电子受体氧化胞内贮存产生能量,从而进行过量吸磷.由于反硝化聚磷菌可以 这两个不同的生物过程借助同一种细在缺氧条件下吸磷，这就使得吸磷和反硝化(脱氮) [4]菌在同一环境中完成。因此，这不仅节省了传统工艺中反硝化所需的碳源，避免了反硝化菌和聚磷菌之间的竞争，同时也节省了好氧吸磷的耗氧量，使供气量只需满足好氧硝 [5、6]化即可。 [,]2目前重庆大学城市建设与环境工程学院罗宁等的试验研究，在A/O池厌氧段和缺氧段已驯化的污泥中分离出具有硝酸盐还原性和超量吸磷这两种生化特性的细菌——反硝化聚磷菌(DPB)，并通过鉴定其生化特性，发现反硝化聚磷菌属于假单胞菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌科细菌、气单胞菌属和部分棒状杆菌属等。由此可见，要真正界定反硝化菌和聚磷菌之间的，同时拥有硝酸盐还原性和超量吸磷这两种生化特性的细菌的反硝化聚磷菌宜于从细菌的生化特性入手进行研究。 2在前期的研究中发现，在在A/O池厌氧段和缺氧段未驯化的污泥中有反硝化聚磷现 2象。故本研究的目的是对A/O池厌氧段和缺氧段的污泥进行反硝化聚磷菌的筛选、分离及纯化，并对分离出的细菌进行生化指标的鉴定，以确定反硝化聚菌的菌属。从而为单菌株的吸放磷特性研究提供纯菌种。 2而研究的方向有两个，一是先用反硝化培养基从A/O池厌氧段和缺氧段未驯化的污泥中筛选分离反硝化菌，通过细菌生化指标的的鉴定，确定菌种的菌属，从而寻找出反 1 2硝化聚磷菌(DPB)，此为本人 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 研究的方向。二是先用醋酸盐金属培养基从A/O池厌氧段和缺氧段未驯化的污泥中筛选分离聚磷菌，通过细菌生化指标的的鉴定，确定菌种的菌属，从而寻找出反硝化聚磷菌(DPB)。 2 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 2.1 材料 2.1.1 菌株的来源 时间:2005年3月19日 2地点:大坦沙污水处理厂A/O池中的缺氧池第三段泥水混合物。 2.1.2 培养基 反硝化培养基:蛋白胨20g，磷酸氢二钠2g，葡萄糖1g，硝酸钾1g，琼脂1g，蒸馏水1000ml，pH=7.0,7.2。 黄豆芽培养基:新鲜黄豆芽200g/L?蒸馏水，煮沸0.5h，纱布过滤，滤液定容至1000ml，加葡萄糖20g，pH=7.0,7.2，硝酸钾10g。 g，琼脂18g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml， 牛肉浸膏蛋白胨培养基:牛肉膏3 pH=7.0,7.2。 2.1.3 设备 表1 设备一览表 名称 型号 厂家 不锈钢手提式压力蒸YXQ,SG46,280S 上海博迅实业有限公司医疗设汽灭菌器 备厂 生化培养箱 LRH,250A 广东省医疗器械厂 单人单面净化工作台 SW,CJ,IFD 苏州净化设备有限公司 冰箱 BCD,215HC 华凌 全温振荡器 HZQ,QX 中国哈尔滨东联电子技术开发 有限公司 2.2 方法 2.2.1 反硝化菌的选择性培养 2.2.1.1 利用反硝化培养基筛选反硝化细菌 2 按2.1.2配制反硝化培养基，灭菌备用。将泥水混合物稀释，接种于反硝化培养基 -4-6中，浓度为10,10。并置于27,30?的恒温培养箱中培养7天。 2.2.1.2 利用黄豆芽培养基筛选反硝化细菌 按2.1.2配制黄豆芽培养基，灭菌备用。将泥水混合物稀释，接种于黄豆芽培养基 -4-6中，浓度为10,10。置于30?的全温振荡器中振荡培养4天。 2.2.2 特征菌落的分离与纯化 2.2.2.1 涂布法分离菌落 按2.1.2配制牛肉膏蛋白胨培养基，灭菌后倒平板。稀释菌液(2.2.1.1和2.2.1.2 -6-8所接的菌种)，稀释度为10,10。吸取0.2ml的菌液于平板上，用涂布玻棒均匀地把菌液涂开，目的是将聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落。每个菌种涂的时间为1min。将接种好的培养基置于27,30?的恒温培养箱中培养3天。 2.2.2.2 平板划线法分离菌落 对2.2.2.1所分离的菌落进行菌落形态的观察，挑取特征的菌落，并对特征菌落进行分离及纯化。 在无菌操作条件下，用接种环挑取少量特征菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上部轻划3条直线(切勿划破培养基)，再将接种环烧红，放入培养皿内降温后，沿刚才划的第二条线起垂直向下画2条线(目的是把菌种带出)，再烧红接种环，冷却后，沿刚才划的线再横向划1,2条线。如下图所示: 将接种好的培养基置于27,30?的恒温培养箱中培养3天。 2.2.3 单个菌株的保存 经过4次划线分离后，可得到单个菌株。菌株的保存方法为斜面培养保存法。把菌株接到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上(把已灭菌的装有牛肉膏蛋白胨的试管取出，趁热斜置在木棒上，使试管内的培养基斜面长度为试管的1/3,1/2之间，待培养基凝固后即成斜面)。置于27,30?的恒温培养箱中培养2天，后放入-4?冰箱中保存。斜面细菌每月转接一次。 2.2.4 细菌活化 3 从2.2.3所接的斜面中挑取适量菌种，接种于250ml牛肉浸膏蛋白胨液体培养基中(按配方要求，不加琼脂)，将接种好的培养基置于30?培养2天。 [8]2.2.5 细菌的生化特性鉴别 通过反硝化培养基对缺氧段泥水混合物的筛选，分离出反硝化菌。根据菌种的群体形态,有白色，扁平，边缘规则和边缘不规则似毛毯状的菌落，对分离纯化后的反硝化菌进行革兰氏染色，观察其细胞形态，革兰氏染色阴性菌为中球状或短杆状，革兰氏染色阳性菌为杆状，查《常见细菌系统鉴定手册》，分离的菌种为兼性厌氧菌，细菌主要的生理生化特性包括有:硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、葡萄糖酸盐氧化、葡糖糖氧化发酵、吲哚、异染粒、氧化酶、接触酶、Giltay产气特性测定。 2.2.5.1 革兰氏染色 染剂:结晶紫的混合液，碘液， 95%的乙醇，番红染液。 操作:用接种环挑取少量待测的菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中，风干或用酒精灯烘干(切勿温度太高)固定 ? 用结晶紫的混合液染1min后，用水冲洗 ? 碘液作用1min，水洗，吸干 ? 用95%乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色(约30s)? 用番红溶液染1min，水洗，风干 ? 镜检(油镜)。 结果观察:深紫色为革兰氏阳性细菌;红色为革兰氏染色阴性细菌。 注意:染色用的菌种要培养18,24h的菌苔，目的是防止芽孢的生长影响染色的结 +-果。且染色要用已知革兰氏染色结果的菌种(G，苏云金杆菌和G，大肠杆菌)与待测定的菌种做对比。 2.2.5.2 硝酸盐还原测试 培养基:牛肉膏0.75g，蛋白胨1.25g，KNO0.25g，蒸馏水250ml，pH=7.0,7.6。3 每管分装4,5ml，121?蒸气灭菌15,20min。 试剂:格里斯氏试剂， A液:对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150ml; B液:α,萘胺0.1g，蒸馏水20ml，稀醋酸(10%左右)150ml。二苯胺试剂:二苯胺0.5 g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。 接种:将测定的菌种接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1，3，5天。另留一管不接种作对照。 操作:取一支干净的空试管，倒入少许培养1，3，5天的培养液，各加一滴A液和B液，在对照管中同样加入A液，B液各一滴。 结果观察:当培养液滴入A，B液后，溶液如变成粉红色，玫瑰红色，橙色，棕色等 4 表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加入一、二滴二苯胺试剂，此时如有蓝色反应，则表示培养基中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用;如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。 2.2.5.3 亚硝酸盐还原测试 亚硝酸盐培养基的制备:牛肉膏10g，蛋白胨5g，蒸馏水1000ml，亚硝酸钠1g，pH=7.3,7.4。分装试管，121?蒸气灭菌15min。 试剂:同硝酸盐相同 接种:将测定的菌种接种于亚硝酸盐液体培养基中，置30?培养1，3，7天后测定。 结果观察:加试剂A液和B液各一滴，如红色消失而产氨则为阳性，加试剂为红色说明不分解亚硝酸盐为阴性。 2.2.5.4 葡萄糖酸盐氧化测定 试剂:1/15mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液配制，1/15mol/L KHPO( KHPO，24 249.078g/L ) ，1/15mol/L NaHPO?12HO ( NaHPO?12HO，23.876 g/L ) 242242 按1/15mol/L KHPO 3ml和1/15mol/L NaHPO?12HO 7ml的比例混合即配成pH约24 242 为7.2的磷酸盐缓冲液。 裴林试剂:A液:结晶硫酸铜34.64g，蒸馏水500ml;B液:酒石酸钾钠173g，氢氧化钾125g，蒸馏水500ml。使用时A液和B液等量混合，当日使用。 操作:用pH 7.2的磷酸盐缓冲液配成含有1%葡萄糖酸盐的溶液。分装试管，每管2ml，灭菌(112?，30min)。取适温培养18,24h的斜面的待测培养物，刮取菌苔，在2ml的葡萄糖溶液中制成浓厚的均匀菌悬液。置30?过夜。然后每管加入0.5ml的裴林试剂，放入沸水中煮沸10min。 结果观察:试管中蓝色液体变成黄绿、绿橙色，或出现红色沉淀为阳性反应。如不变色仍为蓝色为阴性反应。 2.2.5.5 葡萄糖氧化发酵测定 休和利夫森二氏培养基:蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.2g，葡萄糖10.0g，琼脂6.0g，溴百里酚蓝1%水溶液3ml(先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%的水溶液)，蒸馏水1000ml。pH=7.0,7.2，分装试管，培养基高度约为4.5cm，115?蒸气灭菌20min。 接种:以18,24h待测的幼龄菌种作种子，穿刺接种，每株2支。其中一支用灭菌 5 的凡士林石蜡油(熔化的2/3凡士林中加入1/3液体石蜡，高压灭菌)封盖，以隔绝空气为闭管。另一支不封油为开管。同时还要有不接种的闭管和开管作对照。适温培养1，2，3，7天观察结果。 结果检查:只有开管产酸变黄者为氧化型;开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。 2.2.5.6 吲哚的测定 培养基:1%胰蛋白胨水溶液;调pH=7.2,7.6，分装1/3,1/4试管，115?蒸气灭菌30min。 接种:把新鲜的待测菌种接种于上述培养基中，于适温培养。 试剂:对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇(95%)760ml，浓盐酸160ml。 测定:培养1，2，4，7天的培养液，沿管壁缓缓加入3,5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加4,5滴乙醚至培养液，摇匀，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加入吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。 2.2.5.7 异染粒的测定 染剂:甲液，甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿0.20g，冰醋酸1ml，乙醇(95%)2ml，蒸馏水100ml;乙液，碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml 操作:用接种环挑取少量待测的菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中，风干或用酒精灯烘干(切勿温度太高)固定 ? 用甲液染5min ? 倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染1min ? 水洗，吸干 ? 镜检(油镜) 结果观察:异染粒呈黑色，其他部分呈暗绿色或浅绿色。 注意:染色用的菌种要培养18,24h的菌苔，目的是防止芽孢的生长影响染色的结果。且染色要用已知异染粒结果的菌种做对比。 2.2.5.8 氧化酶的测定 试剂:盐酸二甲基对苯二胺1%水溶液 操作:在干净的培养皿中放入一张滤纸，滴上盐酸二甲基对苯二胺1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接种环取18,24h的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上， 结果观察:在10s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，10,60s现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。 2.2.5.9 接触酶的测定 试剂:3%,10%过氧化氢 6 接种:将待测的斜面菌种，用接种环挑取一小环涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上。 结果观察:如有气泡产生为接触酶阳性(有过氧化氢酶)，无气泡为接触酶阴性(无过氧化氢酶)。 2.2.5.10 Giltay产气特性测定 Giltay培养基:A溶液:硝酸钾1.0g，天冬酰胺1.0g，1%BTB酒精溶液5ml，蒸馏水500ml。B溶液:柠檬酸钠8.5g，MgSO?7HO 1.0g， FeCl?6HO 0.05g， KHPO 1.0g， 423224CaCl?2HO 0.2g，蒸馏水500 ml。混合A、B两溶液，调节pH=7.0,7.2。 22 操作:将Giltay液体培养基分装于大试管中，把缠有细线的小试管倒立放入试管中，并将小试管中的气体排净，塞住大试管，留部分细线在大试管外，便于小试管的提升和降落，灭菌备用。 接种:用已灭菌的Giltay液体培养基2ml洗下待测的菌种，转入盛有小试管和Giltay液体培养基的大试管中，将小试管提升一段距离，以便收集气体。30?恒温培养10,14天。 结果观察:Giltay液体培养基的颜色有墨绿色变成深蓝色，小试管内有气泡，表示有菌种有反硝化作用，并有产气特性。 3 结果与讨论 3.1 筛选培养的结果与讨论 2将A/O池缺氧段泥水混合液接种到反硝化培养基和黄豆芽培养基后，其培养基内细菌生长现象对比如下表2和图1所示。 表2 培养基内细菌生长现象 培养基 培养时间(天) 现象 培养基呈淡黄色浑浊，内有白色絮状物和白色胶核，反硝化培养基 7 液面上有一层白色的菌膜，底部有少量沉淀物。 黄豆芽培养基 5 培养基呈淡黄色浑浊，较澄清。 7 图1 左:反硝化培养基;右:黄豆芽培养基 细菌在半固体或液体培养基的生长状态随细菌属，种的特征而异。由于细菌均匀分布于培养基中，使培养基浑浊。而细菌相互凝聚，使出现胶核。有沉淀的现象说明细菌凝聚成大颗粒而沉在管底。 由实验的结果可知，通过反硝化培养基和黄豆芽培养基的筛选都能够分离出反硝化菌。采用传统反硝化培养基培养需要7天的时间才能培养出足够量及足够活性的反硝化菌，需要较长的时间，所用药物较多，成本上有耗费。虽然采用黄豆芽培养基只需5天就能培养出足够量足够活性的反硝化菌，细菌生长周期比在传统反硝化菌培养基蛋白胨培养基中生长周期短，而且所用药物并不多，效果较理想。但传统反硝化培养基分离出来的菌种数量较黄豆芽多。故分离反硝化菌用传统的反硝化培养基效果好。 3.2 菌种分离纯化过程中的结果与讨论 通过反硝化培养基和黄豆芽培养基前期的筛选作用，菌落在牛肉膏平板上的生长现象如下图2，对比如下表3。 表3 平板上菌落的生长现象 培养基 培养时间(天) 现象 白色、湿润、少量光泽、边缘不规则似毛毯反硝化培养基筛选 3 状的菌落 白色、扁平、湿润、光滑、边缘规则、无光黄豆芽培养基筛选 3 泽的菌落 8 图2 反硝化菌平板上生长现象 通过反硝化培养基和黄豆芽培养基的24h的培养，细菌的菌落数量统计如下表4所示。 表4 细菌数量的统计表 反硝化培养基 黄豆芽培养基 66细菌数量 100×10 60×10 3.3 菌株生化特性测试结果 3.3.1菌种部分生化测试结果示意图 3.3.1.1 革兰氏染色 +-用已知革兰氏染色结果的菌种(G，苏云金杆菌和G，大肠杆菌)与待测定的菌种做对比。染色结果见下图5、图6。 图5 革兰氏染色阴性菌 图6 革兰氏染色阳性菌 与苏云金杆菌作对比 与大肠杆菌作对比 3.3.1.2 硝酸盐还原测试结果示意图 将菌种接入硝酸盐还原培养基培养24h后，滴加格里斯试剂，菌液呈现红色，表明 9 菌液有亚硝酸盐存在。其中图3为滴加试剂前，左:经反硝化培养基筛选的菌种，右:经黄豆芽培养基筛选的菌种;图4为滴加试剂后。 图3 滴试剂前 图4 滴试剂后 将分离出的纯菌接种到硝酸盐培养基，经过24h的培养后，滴加格里斯氏试剂，全部菌种都有显色反应。说明反硝化细菌在硝酸还原酶的作用下，硝酸盐还原为亚硝酸盐，而且还原极为迅速，由培养一天后全部菌种就有显色反应可见 3.3.1.3 亚硝酸盐还原测试示意图 将菌种接入亚硝酸盐还原培养基培养1、3、7后，滴加格里斯试剂为红色，说明不分解亚硝酸盐为阴性。图7为滴加试剂前，左:经反硝化培养基筛选的菌种，右:经黄豆芽培养基筛选的菌种;图8为滴加试剂后。 图7滴试剂前(培养7天) 图8滴试剂后(培养7天) 在亚硝酸盐还原测定中，经过1、3、7天的培养和测试，都说明的菌种为亚硝酸盐阴性菌。也就是说具有反硝化作用的菌株没有通过亚硝酸还原酶的作用，亚硝酸盐不能进一步还原为氧化亚氮或氮气，反硝化作用不强，故下一阶段需要进一步的驯化，加强反硝化的作用。 10 3.3.1.4 吲哚测试结果示意图 将菌种接入测吲哚用的培养基培养24h后，滴加试剂，培养基液层表面呈红色，既为阳性反应。其中图9为滴加试剂前，左:经反硝化培养基筛选的菌种，右:经黄豆芽培养基筛选的菌种;图10为滴加试剂后。 图9 滴试剂前 图10 滴试剂后 3.3.1.5 葡萄糖氧化发酵结果示意图 将菌种接到休和利夫森二氏培养基培养的观察结果图。其中图11、13为培养基1天和7天的闭管示意图，左:经反硝化培养基筛选的菌种;中:经黄豆芽培养基筛选的菌种;右:空白对照管。图12、14为培养1天和7天的开管示意图，左:经反硝化培养基筛选的菌种;中:经黄豆芽培养基筛选的菌种;右:空白对照管。 图11 培养1天(闭管) 图12 培养1天(开管) 图13 培养7天(闭管) 图14 培养7天(开管) 11 由上述图可知，菌种接入休和利夫森二氏培养基培养1天后，试管(包括开管和闭管)上部少量的培养基由于细菌的呼吸作用，有产酸变黄者的现象。培养7天后，培养基全部变为黄色。并可根据生长状况判定细菌的呼吸类型，由培养基全部变黄可见，细菌是沿穿刺线自上而下生长，为兼性厌氧菌或兼性好氧菌。 3.3.2 菌种的细胞形态描述 通过革兰氏染色镜检观察分离出的反硝化菌的细胞形态描述如下表5所示: 表5 细胞形态 革兰氏染色结果 细胞形态 + 杆状 G - 短杆状或中球状 G 3.3.3 反硝化培养基筛选结果 利用反硝化培养基从缺氧池中筛选出来了7个菌株，经过生化特性的鉴别后，其结果如下表6所示。 表6 细菌生化特性鉴别结果表 测试项目 1 2 3 4 5 6 革兰氏染色 , ， , ， , , , , , , 氧化酶 ， ， ， ， ， ， 硝酸盐还原 f f f f f f葡萄糖氧化发酵 , , , , , , 葡糖糖酸盐氧化 ， ， ， ， ， ， 触酶 ， ， ， ， ， ，吲哚 异染颗粒 ， ， ， ， ， ， , , , , , ,亚硝酸盐 Giltay产气特性 , , ， ， ， , 试验 12 注: ，，为阳性;,，为阴性; f，发酵型; Giltay产气特性试验 :，，表示有气泡产生;,，表示无气泡产生。 从表6细菌的生化鉴定的结果和附录1可知，用反硝化培养基从缺氧段的污泥中筛选分离出来的6株反硝化菌为肠杆菌科和棒状杆菌属。 3.3.4 黄豆芽培养基筛选结果 利用黄豆芽培养基从缺氧池中筛选出来了4个菌株，经过生化特性的鉴别后，其结果如下表7所示。 表7 细菌生化特性鉴别结果表 测试项目 1 2 3 4 革兰氏染色 ， , , , , , , , 氧化酶 ， ， ， ，硝酸盐还原 f f f f葡萄糖氧化发酵 , , , ,葡糖糖酸盐氧化 触酶 ， ， ， ， ， ， ， ， 吲哚 ， ， ， ，异染颗粒 , , , , 亚硝酸盐 , , , ,Giltay产气特性试验 注:注: ，，为阳性;,，为阴性; f，发酵型; Giltay产气特性试验 :，，表示有气泡产生;,，表示无气泡产生。 从表7细菌的生化鉴定的结果和附录1可知，用黄豆芽培养基从缺氧段的污泥中筛选分离出来的4株反硝化菌为肠杆菌科和棒状杆菌属。 3.4 菌株鉴别结果 3.4.1 缺氧段筛选反硝化菌的鉴定结果 2根据3.3所示的菌株生化特性鉴别结果，取A/O池缺氧段泥水混合物，分别通过反硝化培养基和黄豆芽培养基的筛选，分离出来的10株纯菌，其鉴别结果数量统计见表8。 13 表8 菌株鉴别结果数量统计表 菌属 肠杆菌科(数量:株) 棒状杆菌属(数量:株) 反硝化培养基 4 2 黄豆芽培养基 3 1 所占百分数(%) 70 30 根据上述表8的结果，缺氧段分离出来的反硝化菌为肠杆菌科和棒状杆菌属，根据 [7]重庆大学城市建设与环境工程学院罗宁等的鉴定结果可知，肠杆菌科和棒状杆菌属都为反硝化聚磷菌(DPB)。 3.4.2 缺氧段与厌氧段所分离的反硝化菌鉴定结果的对比 厌氧段通过反硝化培养基和黄豆鸭培养基的筛选、分离出来的反硝化菌的菌属如下表9所示: 表9 反硝化菌的鉴定结果 气单胞菌属 肠杆菌科 棒状杆菌属 厌氧段(数量:株) 1 0 8 缺氧段(数量:株) 0 3 7 缺氧段分离出的菌属与厌氧池段分离的菌属不同: 1、厌氧段分离的反硝化聚磷菌为肠杆菌科和气单胞菌属。 2、缺氧段分离出来肠杆菌科和棒状杆菌属。 其中肠杆菌属相同，气单胞菌属和棒状杆菌属不同。 从厌氧段和缺氧段用反硝化培养基和黄豆芽培养基筛选、分离出来的反硝化菌都为 [7]反硝化聚磷菌(DPB)，与重庆大学城市建设与环境工程学院罗宁等的鉴定结果相符合。 3.4.3 反硝化菌与聚磷菌鉴定结果的对比 反硝化聚磷菌的培养基是通过反硝化培养基和醋酸盐金属培养基分别筛选出反硝化菌和聚磷菌，然后后对分离的菌种进行细菌生化特性方面的鉴定，确定菌种的菌属，从而寻找反硝化聚磷菌。 通过醋酸盐培养基筛选、分离的反硝化聚磷菌，其菌属如下表10所示: 14 表10 反硝化聚磷菌的鉴定结果 气单胞菌属 肠杆菌科 棒状杆菌属 葡萄球菌 厌氧段(数量:株) 4 2 0 0 缺氧段(数量:株) 2 0 5 1 从上述表10可知，醋酸盐金属培养基比反硝化培养基分离出的菌属多，缺氧段分离出的菌属比厌氧段分离的菌属多，进行反硝化聚磷菌的培养时优先选用醋酸盐金属培养基。 4 结论 4.1 反硝化菌在黄豆芽培养基的生长周期比用传统的反硝化培养基长，但分离出的菌种的数量少。 4.2 通过反硝化培养基筛选出来的菌种经硝酸盐还原测试、亚硝酸盐还原测试和Giltay产气特性试验后，其反硝化作用不强，需要进一步的驯化加强反硝化的效果。 4.3 通过细菌的生化特性鉴别，分离出来反硝化菌为肠杆菌科和棒状杆菌属，属于反硝化聚磷菌(DPB)。 4.4 通过反硝化培养基的筛选分离出来的反硝化菌，缺氧段分离出来菌种的数量较厌氧段多，选择菌源时优先考虑选用缺氧段。 4.5 在菌属上，厌氧段分离出来的反硝化菌主要有肠杆菌科和气单胞菌属。而缺氧段分离出来的反硝化菌主要为肠杆菌科和棒状杆菌属。 4.5 醋酸盐金属培养基比反硝化选择性培养基分离出的菌属多，进行反硝化聚磷菌的培养时优先选用醋酸盐金属培养基。 综合上述可见，通过研究反硝化菌和聚磷菌这两个不同的方向来寻找反硝化聚磷菌， 2都成功证明A/O法的生活污水厂的厌氧和缺氧段的未驯化的污泥中存在反硝化聚磷菌。 15 致 谢 经过一年多的实验研究，论文终于顺利完成。在此我非常感激刘晖和周康群老师孜孜不倦的指导，使我从中受益非浅;感谢刘洁萍老师和植保系的老师在实验的设备与药品对我们实验的大力支持。特别是在实验探讨过程中，老师们不厌其烦地为我们解答，耐心地引导着我们，让我的理论和实践结合的能力得到很好的锻炼，我衷心地向老师们说声谢谢。最后还要感谢协助我的同学。 参 考 文 献 [1] 张玉芹 刘开启 王革等.反硝化菌的筛选与培养条件的研究.农业环境科学学报，2005.24(1):165-168。 --[2] 杨聪和 孙力平 李秀敏等.NO，NO作为生物除磷最终电子受体的研究初探.天津城32 市建设学院学报，第11卷 第2期，2005年6月。 -[3] 刘晖 周康群 刘开启.利用NO,N作为电子受体的反硝化聚磷的研究现状.广州仲恺2 农业技术学院环保系。 [4] 赫哓地 刘壮.欧洲水环境控磷策略与污水除磷技术.[J] .给排水.1998，24(8):69273。 [5] Kuba T, M C M Van Loosdrecht, et al.Phosphorus Removal From Wastewater By Anaerobic-anoxic Sequencing Batch Reactor [J]. Wat. Sci.Tech., 1993,27(5~6):241~252. [6] Bortone G, et al. Anoxic Phosphate Uptake in The Dephano Process [J] . Wat. .Sci. .Tech., 1999,4~5(40):177~180. [7] 罗宁 罗固源 许晓毅.从细菌的生化特性看生物脱氮与生物除磷的关系.重庆大学城市建设与环境工程学院，第11卷 第2期，2005年3月。 [8] 东秀珠 蔡妙英等编著.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社。 [9] 俞树荣.微生物学和微生物学检验.北京:人民卫生出版社，1999年2版。 16 英文摘要: The Screening、Purification and Identification of Denitrifying Phosphorus Removing Bacteria 2 ——A/O anoxic stage of using Denitrifying Culture Medium to Screen, Purify and identify Lu Lixing (Department of Environment Science and Engineering, ZhongKai University of Agriculture and Technology, Guangzhou,510225,China) Abstract:Denitrifying phosphorus removing theory is using the anoxic denitrifying phosphorus removing bacteria (DPB).Under the anaerobic condition, the phosphorus was --release, under the anoxic environmen (no O，but have NO),NO was denitrified as electronic 233 acceptor to oxidize the butcher of store, and the phosphorus was excessively accumulate.In the errly days,it found out that, in hasn’t domesticated sludge has denitrifying phosphorus removal phenomenon. Therefore ,the purpose of this research is that ,to get the anaerobic and 2anoxic section sludge in A/O pond ,and then carry on the denitrifying phosphorus removal of screening and purification. And then, bacteria were carried on the physiological biochemistry experiment in order to identify the species. Thus attracts for the single strain puts the phosphorus characteristic research to provide the pure mold mushroom spawn. The result 2shows that, in A/O pond of anoxic section sludge can screen the denitrifying phosphorus removing bacteria, which were Enterobacteriaceae and Corynebacterium.And from the result ,we find that it is better to choose acetste mineral medium to sreen the anoxic section sludge when culture the denitrifying phosphorus removing bacteria. Keywords Anoxic Denitrification bacteria Denitrifying phosphorus removing bacteria Bacterium biochemistry characteristic 17 附 录1 ，[89] 细菌鉴别的主要生化特性 测试项目 肠杆菌科 棒状杆菌属 气单胞菌属 葡萄球菌 革兰氏染色 , ， , ， ， , 氧化酶 , , ， ， 硝酸盐还原 ， V 葡萄糖代谢 f f f f 触酶 ， ， ， ， 吲哚 V ND d ， 异染颗粒 ， ， ， ， 细胞形态 中球杆 杆，棒状 中球杆 球形，成对或成堆 中等大小，有白、黄、菌落特征 中等大小 中等大小 中等大小 奶酪色 注:，，?90%菌株为阳性;,，?90%菌株为阴性; V，种间不定的反应;ND，未测 出; f，发酵。 18 学 生 承 诺 书 本 毕业论文 毕业论文答辩ppt模板下载毕业论文ppt模板下载毕业论文ppt下载关于药学专业毕业论文临床本科毕业论文下载 的实验部分是在老师的带领和指导下，和同学合作完成的，而本文章是在老师的指导下独立完成的，绝不是抄袭别人的成果，若有虚假，本人愿对本毕业论文的真实性负全部责任。 本人签名: 二零零六年六月十一号 19 农业技术学院毕业论文( 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 )成绩评定表 姓 名 学 号 2006届 院(系)别 环境科学与工程系 专业、班级 环境工程021班 2反硝化聚磷菌的分离、纯化及鉴定 —— A/O缺氧段利用反硝化培养基 毕业论文(设计)题目 进行分离、纯化及鉴定 指导教师姓名、职称 论文(设计)摘要: 反硝化聚磷原理是利用兼性厌氧反硝化聚磷菌(DPB，Denitrifying Phosphorus Removing -Bacteria)，在厌氧条件下释磷,缺氧条件下(无O，存在NO)，以硝酸盐为电子受体氧化胞内贮23 存产生能量,从而进行过量吸磷。在前期的研究中发现，在未驯化的污泥中有反硝化聚磷现象。 2故本研究的目的是对A/O池厌氧段和缺氧段的污泥进行反硝化聚磷菌的筛选、分离及纯化，并对分离出的细菌进行生化指标的鉴定，以确定反硝化聚菌的菌属。从而为单菌株的吸放磷特性研 2究提供纯菌种。结果显示:在A/O池缺氧段污泥中，通过反硝化培养基可分离出肠杆菌科和棒状杆菌属。并由结论可以看出，对反硝化聚磷菌进行筛选培养时，优先采用醋酸盐金属培养液对缺氧段污泥进行筛选培养，能分离出较多的反硝化聚磷菌。 指导教师 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 意见及成绩评定: 签名: 年 月 日 20 立题正确、设计论点明确、论据文字通顺、格式得得 合理、工作态度认充足。 规范。 分分论文质量 真。 小合 (满分70(满分20分) (满分40分) (满分10分) 计 计 分) 宣读论文重点突出、简明扼论文答辩中回答问题准确， 要。 反应敏捷、思路宽广。 论文答辩 (满分10分) (满分20分) (满分30分) 答辩小组 对论文(设 计)成绩评 定 答辩组长签名: 年 月 日 院系答辩 领导小组 最后评定 成绩 签名: 年 月 日 注:1、90分以上为优秀、80-89分为良好、70-79分为中等、60-69分为及格、59分以下为不及格。 2、本表一式两份，一份随毕业论文装订存档，一份以学生班为单位按学号装订成册存档。 21