草鱼“肝胆综合症”病理变化及菜籽粕对其肝脏毒性研究

草鱼“肝胆综合症”病理变化及菜籽粕对其肝脏毒性研究 草鱼“肝胆综合症”病理变化及菜籽粕对其肝脏毒性 研究 华中农业大学 硕士学位论文 草鱼“肝胆综合症”病理变化及菜籽粕对其肝脏毒性的研究 姓名:刘迁 申请学位级别:硕士 专业:水产养殖 指导教师:陈孝煊 20090601 华中农业大学2009届硕士学位论文 草鱼“肝胆综合症，，病理变化及菜籽粕对其肝脏毒性的 研究 摘要 本文采用组织学和生物化学的方法，对肝脏病变草鱼的血液生化指标和肝脏 组织结构进行研究，探讨草鱼肝胆综合症的病理变化;同时从营养毒理学的角度 研究了饲料中不同比例菜籽粕 O、16,、3(2,、48,和64, 对草鱼幼鱼生长、 生化特性、鱼体组成、肝脏糖原和脂肪含量以及肝脏组织结构变化等方面的影响， 为养殖草鱼过程中肝胆综合症的成因做理论基础;并从细胞水平研究了异硫氰酸 丙烯酯对原代培养肝细胞的毒性以探索菜粕对草鱼毒性的机制。结果如下: 1(与肝脏正常草鱼相比，肝脏病变组草鱼肝脏颜色变淡、甚至变绿;肝细胞发 含量和ALP活性无显著性差异 尸 O(05 ; SOD显著性降低 尸 0(05 ，补体C3、 胗0(05 ;肝糖原显著性降低 氏O(05 ，C4含量有所降低但差异不显著 肝中脂 肪含量有所增加但差异不显著 尸 O(05 。 2(不同菜籽粕替代水平实验结果为:对照组增重率最高，菜籽粕含量达32, 以上时与对照组相比显著降低 尸 0(05 ;菜籽粕含量在0,-48,各组，日摄食率无 16,组最高，32,组最低，但各组间均无显著差异;特定生长率随着饲料中 菜籽粕 比例的增加而下降，其中以对照组最高，32,(!组与对照组相比显著性降低 氏0(05 ; 蛋白质效率以16,组最高，48,和64,组与其它各组相比显著降低 氏O(05 ;粗 蛋白质、粗灰分和水分含量均无显著差异 尸 0(05 ;32,组粗脂肪含量最高，16, 组 尸 O(05 : 随着菜籽粕水平的增加，草鱼血清中胆固醇 cHo 、甘油三酯 TG 的含量 逐渐升高但无显著差异 尸 0(05 ，当菜籽粕含量在32,以上时血清尿素氮 BUN 草鱼“肝月【!综合症”病理变化及菜籽粕对其肝脏毒性的研究 著性差异，天门冬氨酸转氨酶 AST 、丙氨酸转氨酶 ALT 呈明显上升趋势， 但无显著性差异;草鱼肝脏的糖原和脂肪沉积量有显著变化，糖原含量以32,组 含量最低，第48,组含量最高，16,组、48,和对照组组间无显著性差异 尸 O(05 ， 著性降低 尸 O(05 ;添加菜籽粕组脂肪含量与对照组相比显著升高 砌(05 ， 其中以64,组含量最高，32,组其次，64,组和32,组间无显著性差异，而16, 组和48,组显著性低于第32,组和64,组;组织切片观察到，在添加菜籽粕16, 组发现有出现脂肪变性的细胞，添加菜籽粕32,组，同样存在脂肪变性，同时可 见部分细胞发生细胞核发生偏移的现象，随着菜籽粕水平的增加，脂肪变性加剧， 脂肪沉积程度更甚，对肝脏的损伤更严重。 3(异硫氰酸丙烯酯 AITC 对培养的草鱼肝细胞有影响。未加药物对照组以 成活细胞为主，出现部分死亡细胞;10。5 mol,L 4AITC药物组可见一些贴 情况良好与对照组无区别;100mol,LAITC和10‘ 壁细胞成活细胞，部分细胞开始脱壁，逐渐变圆，且发现细胞核偏移现象;10之mol,L 址TC高浓度组几乎全部细胞死亡后悬浮于培养基中;AST、刖(一T活性以10之组最 低，显著低于对照组 尸 O(05 ;其它各组与对照组相比AST活性升高，但无显 著差异 胗O(05 ;10弓mol,L和10‘4 mol ,L、 LDH测定值以10之mol,L组最高，10刁mol,L组次之，显著高于对照组， 10‘4 加，MDA含量呈显著上升趋势 尸 O(05 。 关键词:草鱼;生化指标;肝脏;组织结构;异硫氰酸丙烯酯;菜籽粕; 毒 性 华中农业大学2009届硕:,学位论文 of Pathologicalchangesgrasscarp Ctenopharyngodonidellus with andthe of mealon toxicity syndrome rapeseed liverof grasscarp Abstract Inthis andbiochemicalmethodswereusedto the paper,histological investigate ofbloodbiochemicalindicesand sbuctlJI(ein carp、 I，inl changes histological grass diseased studieswereconductedto the liver(Further,nutritionaltoxicology investigate effectsofdifferent dietaryrapeseedmeal I己M levels O，16,，32,，48, and64, on biochemical and utilization，bloodindices，fish growth,feed bodycomposition， lipid levelsin andliver ofthe addition,the glycogenhepatopancreaspathologygrasscarp(In effectsofAITConthe of culturedlivercellsof were carp toxicityprimordial grass studiedtorevealthemechanismof of meal onfish(Theresults toxicityrapeseedacting wereasfollows: 1(Incontrastedtofishwithnormal infish、? ithabnormal liver,the hepatopancreas livershowed cellsinfish嘶廿 labnormalliver pale，evengreencolor;thehepatic of showedvacuoleandnecrosistosome activities and fatty extent;Serum ALT,AST thecontentsofdirect infishwi廿1 bilirubin,total liver abnormalincreased concentrationsofurea significantly 尸 O(05 (Serumnitrogen andcholesterol showed trendsbutnot increasing serumconcentrationof andALPinfishwimabnormallivershowedno glucose significant ofSODdecreased change P O(05 (Serumactivity andalexin showed trendsbutnot C3，C4 decreasing infish埘th glycogen abnormalliverdecreased liver levelsshowedan trendbutnot lipid increasing significantly俨 0(05 ( 2(Different meal 剐M levelsshowed effectonthe dietaryrapeseed significant of rateWasobservedinthe growthperformancegrasscarp(nehighestweight gain control the ratedecreased the group;andweightgain significantly沪 O(05 asrapeseed III 草鱼“肝月L!综合症”病理变化及菜籽粕对其肝脏毒性 的研究 meallevelincreasedfrom32,to no 64,(Feedingrate FR showedsignificant RM Was differenceinthefirstfour in64, pO(05 ，however，FRgroup groups lowerthantheother feedconversion was highest efficiency significantly groups(The 1 andthelowestin32,RM no observedin 6,RM significant group group，but differencewasobserved growthrate SGR Was amonggroups P 0(05 ;thespecific the ofRM the SGR level，and increasing highest depressedsignificantly P 0(05 by the inthe16,RM wasobservedinthecontrol Was highest group(Proteinefficiency and were lower andthoseofthe48,RM 64,RM group group group significantly thantheother crude ashandmoistureall protein,crude among groups俨 0(05 (Body showedno difference fatof16, and32, groups significant p0(05 ;However，crude RM were thantheother other higher groups P 0(05 ， nosignificant group significantly differencein fatWas body observed P 0(05 ( showed trendas Serumcholesteroland contents increasingdietary triglycerides meallevel did rapeseed increased咿O(05 ，SOaspartate alanine total protein TP and transaminases ALT (Serumglucose GLU ，total no differenceall in significant amonggroups (P 0(05 (When bilirubin TB showed the concentrationofserumurea feed，the significantly nitrogen BUN increased mealcontentreached32,(The hadthe dietary 48,group 俨 0(05 as rapeseed liver the no significant lli曲est glycogencontent，while32,grouplowest 尸 0(05 ， differenceWasobserved16,RM andthecontrol group group among group，48,RM than contentsinthetested were the lipid groupssignificantlyhigher 胗0(05 (Liver control the Wasin64,RM in32,RM highest group( group P 0(05 ，and group，then Therewereno differencebetween64,and 32,eitherfor significant group group and cells谢也 vacuolewere glycogenlipidaggradationsp0(05 (Metamorphic observedin16,RM 32,RM cells晰tll metamorphicvacuole， group(In group，except RM in cellsWasalsoobserved(Asthe level nucleolusexcursion increased，the part numberof cell谢mvacuole accelerated increased，liver metamorphic lipiddeposition liver andthefunctionof Was seriouslydamaged( 3(Thereweresomeeffectsof cultured allylisothiocyanate AITC onprimary livercellsof welland somedeadcellswereobservedin grasscarp(Cellsgrew only controlwithout tothecontr01(cellsin10。 5and10而 group administration(Compared IV 竺主奎些叁兰!塑!昼堡?兰竺丝茎 一。 -__-___--―-――?_____-―--――?___??-_―-??― l_-_--__―――――――――――――――――――――一 一 also well(In10uand and no difference grew AITC showed moI,L groups significant live ofthem tofall exitedsome cells，part began moI,LAITC sticking 10q groups，there inthe nolivecellswerefound high withnucleolusexcursion,and oIf,accompanied were inculture thecells of10。2 all suspended concentration mol,L，nearly group in1 p皿wereobserved0吐mol ,L ofASTand dete力minedvalues medium(Thelowest thanthecontrolandother AITC lower group groups 尸 0??05 ??The group(significantly no difference other showed the P O(05 ?? activmesofAST significant amonggroups and 10一mol,Lwere higher valuesof108mol,L group significantly 灿activity group ALT ValUeSof10。 thecontroland 10。2mol,L，whileactivity tll锄姒of groupgroup with showedno mol,Land10击molIL significant group LDHwasin10,mol,L tlleControl determinedvalueof group， then groIlp(Thehighest no differencewiththecontrol showed in10。tool,L groups significant group(Other ofthe increased withtheincrease contentofMDA significantly group 胗0(05 (The concentrationofAITC沪 0(05 ( meal; carp;biochemical Keywords:grass toxicity V 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 学位论文 是否保密 否 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名:玉1汪 时间:弘彳年石 月8日 j 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注:保密学位论文 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保 密的论文 在解密后适用于本授权书( 糊黼张立1迁 翩张’’彬 签名日期(叩年石月多日 签名吼叩年5月8日 华中农业大学2009届硕上学位论文 第一章文献综述 1(1草鱼肝胆综合症简介 随着集约化养殖的发展，鱼类养殖的密度极大地提高，并主要靠人工配合饲 料喂养，水体环境的恶化日趋严重，强化投饲和乱用药物，以及营养成分的失衡 和饲料中含有毒物质 潘连德，1999 等因素，大大加重了鱼类的肝脏解毒负担， 越来越严重地造成鱼类肝脏的损害。目前，湖北省养殖的草鱼、鲫等鱼类普遍存 在着不同程度的肝脏病变，通称为“鱼类肝胆综合症"。“鱼类肝胆综合症”是一 个比较笼统的概念，这里主要是指由各种非寄生性因素引起的肝脏损伤、肝功能 障碍的疾病。 当前在我国比较突出的鱼类肝胆综合症，由于主要发生在鲤、鲫、草鱼、团 头鲂和罗非鱼等常规主养鱼类中，因此为广大养殖业者所关注。对于鱼类的肝胆 综合症，表现为以下的一些症状 曾宪君和黄媛秀，2004 ??病鱼发病初期，体形 正常，体色鲜亮，解剖鱼体，可见病鱼肝脏略肿大，轻微贫血，色略淡，胆色较 暗，略显绿色。随着病情逐步发展，病鱼肝出现不同程度肿大，严重者可比正常 情况大1倍以上，肝色逐渐变黄发白或呈斑块状黄白相间，形成明显“花肝”症状， 此时鱼体肝脏轻触多易碎裂，胆囊明显肿大，严重者肿大1,2倍以上，胆汁充盈， 颜色变深或呈墨绿，有时病鱼的脾肾等内脏器官同时病变肿大，导致鱼内脏受损， 鱼体抗病力下降，并常伴有烂鳃、肠炎等传染性疾病。喻运珍等 2006 对患有 肝病的草鱼组织切片观察中发现，肝脏出现了严重的水样变性，无法辨认肝脏细 胞的核膜和核仁，并且毛细胆管出现少量栓塞，部分肝细胞已经胀亡。 开毓 2002 等认为营养性因素、毒性物质和药源性因素等均是此病的诱因， 表 明引起鱼类肝胆病的病因是多因素的。具体发病原因概括如下: 1 养殖密度过 大，水体环境恶化。当水中氨氮浓度含量过高时，鱼体内氨的代谢产物难以正常 排泄，蓄积于血液中，易引起鱼类肝胆疾病的发生。 2 饲料投喂过多，或饲料 营养不适合鱼类营养需要。如蛋白含量过高、碳水化合物含量偏高、或长期使用 动物性脂肪和高度饱和脂肪酸等，导致饲料能量蛋白比过高。其中高蛋白饲料诱 草鱼“肝Hu综合症”瘸理，变化及菜籽孝 I对le盯脏毒性的研究 发肝脏脂肪积累，破坏肝功能，干扰动物体正常生理生化代谢。碳水化合物含量 过高，会引起鱼类糖代谢紊乱，造成内脂肪积累，妨碍正常的机能，其主要病变 部位是肝脏，大量的肝糖原积累和脂肪浸润，造成肝肿大，色泽变淡，外表无光 泽，严重的脂肪肝还可以引发肝病变，使肝脏失去正常机能。 3 饲料氧化、酸 败、发霉、变质。脂肪是易被氧化的物质，脂肪氧化产生的醛、酮、酸对鱼有毒， 将直接对肝脏造成损害 汪开毓，2002 。鲤采食这些饲料一个月后，患瘦背病， 肌纤维萎缩、坏死;虹鳟采食后，引起肝发黄、贫血;草鱼、团头鲂、罗非鱼等 采食后，极易引发肝胆综合症。若麦麸、玉米、菜籽粕、花生粕等受潮发霉，其 产生的黄曲霉素、亚硝基物，对肝脏有很大损害。试验 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ，投喂含有黄曲霉素 保等，1996 。 4 乱用滥用药物。如长期在饲料中添加高剂量喹乙醇、黄霉素等 促生长的药物，或长期添加低剂量呋喃唑酮、氯霉素、磺胺类、四环素族抗生素 等，造成鱼类肝脏损害。或乱用滥用外用杀虫灭菌药，如溴氯菊酯、敌敌畏、敌 百虫、硫酸铜、敌杀死、林丹等，这类药不仅毒性大、高残留、对水体破坏很大， 而且容易蓄积在鱼体内，直接损害鱼体肝脏。 5 维生素缺乏。如胆碱、VE、生 物素、肌醇、VBl和VB6等都是参与鱼体内脂肪代谢，缺乏上述维生素均会造成 鱼体内脂肪代谢障碍，导致脂肪在肝脏中积累，诱发肝病。 6 饲料中含有 有毒 有害物质。如棉籽粕中的棉酚、菜籽粕中所含有的硫甙、劣质鱼粉中的亚硝酸盐 等。据报道，当饲料中的游离棉酚和硫甙含量达到400mg,kg时鲤会产生可观察到 的中毒症状，当以棉粕或菜籽粕作为唯一饲料单独饲喂草鱼时，12周后草鱼生长 速度减缓、停滞、死亡率上升 张虎和曾虹，2001 。 当前养殖鱼类中普遍存在着肝胆综合症，尤其是鲫和草鱼。关于鱼类的肝胆 综合症的生化特征和致病机理目前都还不太了解。 1(2硫苷与水产动物的营养 我国油菜籽产量居世界第1位，每年油菜籽制油后可产生菜籽粕达600,700 万t 严奉伟等，2005 。菜籽粕是一种优良的天然植物蛋白资源，它的蛋白质含 量与氨基酸组成可以与豆粕相媲美。然而，因菜籽粕含有硫代葡萄糖苷 2 华中农业大学2009届硕士学位论文 毒，且会导致饲料适13性较差。虽然目前菜籽粕在各种养殖动物的饲料中应用很 广泛，但这些植物性蛋白源中抗营养因子的存在限制了它的应用。其中最主要的 抗营养因子之一就是硫苷。普通菜籽粕中硫昔的含量达100-150肛mol,g，加拿大 莉，2003 。硫苷本身无毒但影响适口性。相当一部分的硫苷均以可被修饰的侧链 的形式存在。已经有超过120种不同的硫苷被鉴定 Chen 它们都有一个共同的结构，即包括p(D(硫葡萄糖、磺酸盐肟和一个由氨基酸衍生 出来的可变侧链。对硫苷主要成分的摄食会损坏动物机体健康并减少其产量。整 个的硫苷或其分解产物被摄食后，被动物肠腔吸收或者被转化成其它的物质 Rowaneta1((1991 。菜籽粕的应用于饲料工业是动物饲料中硫苷的主要 来源。 很长一段时间都认为硫苷可以减少动物的摄食量 Hill，1991 ，导致碘摄入不足 Burelet et et a1(，2000c ，引起肝脏、肾和甲状腺的增生 Burel a1(，2000e; Tripathi et a1(，2001;Mabon et 说明硫苷可抑制鱼类生长并影响甲状腺的功能 Burel ，c 。 a1(，2000如b 1(2(1硫苷的含量与组成 硫苷是芸薹属 Brassica 和十字花科其它植物中重要的一类植物次生代谢产 物，其结构如图1(1所示。根据侧链R基团的不同，可以把硫苷分为3类:脂肪 类 侧链来源于蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸 、芳香类 侧链来 源于酪氨酸和苯丙氨酸 和吲哚类 侧链来源于色氨酸 。在十字花科中相应内源 芥子酶的存在下，硫苷容易水解生成异硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈类等化合物，pH Bet 值和侧链R基团的不同将影响各产物的形成 Seeraa1(，2002 。菜籽粕中含量 较高的硫苷主要有三种:3(丁烯基硫苷，(4(戊烯基硫苷和致甲状腺肿素前体硫苷。 硫苷的含量和分布随着油菜种类和种植地区的差异而有变化。印度次大陆的菜籽 粕中的硫苷主要是3(丁烯基硫苷 Tyagi，2002 ，而欧洲和其它一些温带国家菜籽 et 粕中的硫苷主要是致甲状腺肿素前体硫苷，4(羟基硫苷和3(丁烯基硫苷fMabon et a1(，2000;Leming 究的深入，科学家通过各种手段和方法追求“三高两低”的油菜品种，并取得显著 20--45p(mol,g 袁莉，2003 j 草鱼“肝月L!综合症”病理变化及菜籽棚对其肝脏毒性的研究 ,s一卜D_酉llCOSe R――e ,,N――0S口3 图1(1硫代葡萄糖苷的分子结构 1(1Themolecularformulaof Fig glucosinolate 1(2(2饲料中硫苷的生物学毒理作用 硫苷广泛存在于所有植物的各个部分，也是菜籽饼粕中主要的有害物质，它 是一类葡萄糖衍生物的总称。硫代葡萄糖苷在植物中不是单一存在的，它是以硫代 在完整的植物中，葡萄糖硫苷酶存在于特定的蛋白体中，硫代葡萄糖苷存在于液 泡中，两者是分离的，在加工或取食过程中，植物细胞组织的损坏促进了硫苷与 芥子酶之间的连接，硫苷在植物中芥子酶与由肠道微生物菌群产生的芥子酶 的双 et a1(，2004 。主要有以下4种 重作用下被水解，释放出一系列的水解产物 Cheng 途径降解生成异硫氰酸酯、嗯唑烷硫酮、腈或硫氰酸酯等有害物质。?在接近中 性条件下 pH值为5,7 ，异硫氰酸酯是主要的糖苷产物;?R(基团上带有p(羟 基的硫苷，产生的异硫氰酸酯不稳定，在极性溶剂中通过环化作用生成相应的嗯 唑烷硫酮 甲状腺肿因子 ;?R基团上带有苯基或杂环的硫苷，在中性和碱性条 件下生成游离的硫氰根离子;?在酸性条件下 pH值为3~4 或有还原剂 Fe2+ 存在时生成腈类和硫的量增加。嗯唑烷硫酮阻碍单胃动物甲状腺素的合成，引起 血液中甲状腺素浓度下降，促进垂体分泌更多的促甲状腺激素，使甲状腺细胞增 生，最终导致甲状腺肿大 刘广红，1992 ;菜籽粕中由酶介导的硫苷的水解主要 产生5(乙烯基(2(硫代嗯唑烷硫酮 5(VOT 和硫氰酸盐离子。硫苷对于动物体 的副作用是相对于其在饲料中的含量而言的。异硫氰酸盐味苦，而腈类毒性强， et 对动物机体的生长有消极的影响 Taniia1(，2004 。硫酸氰盐类，硫脲和嗯唑烷 et 硫酮可能会损坏甲状腺对碘的利用能力从而影响到甲状腺的功能 Walliga1(， et a1(，2002 ，包括致突变，肝 2002 。硫苷代谢物还有其它的一些副作用 Wallig et 中毒与肾中毒等 T趾iia1(，2004 。高含量硫苷饲料会降低摄食量，导致生长的 eta1(，2001 。饲料中总硫苷副作用的程度决定于其硫苷 萎缩 Hill，1991;Tripathi 4 华中农业大学2009届硕十学位论文 的含量、组成及其降解产物。不同的物种对硫苷有不同的耐受能力。据报道在投 喂高含量的硫苷饲料的猪、鼠和兔中有较高的死亡率。关于饲料中硫苷对动物生 长与产量的负面影响可能与由抗营养因子引起的机体的严重的内分泌紊乱有关 andMishra，2007 。 Tripathi 1(2(3鱼类对含硫苷饲料的反应 1(2(3(1硫苷对鱼类生长摄食率的影响 一般来讲，菜籽粕的使用对鱼类是有利的，但所有的研究一致认为该添 加量 et et 随着其硫苷含量的不同应该有一定的限度 Forstera1(，2000;Burela1(，2000a， et b，2001;Glencross 生长、血清生化指标和毒素残留的影响研究中提出，草鱼幼鱼饲料中菜籽粕的含 量以不超过30(O,为宜，该试验中随着菜籽粕水平的增加，草鱼的生长和饲料利 用呈下降趋势，但是当饲料中的菜籽粕含量为30(O,时，与对照组、10(O,组和 20(0,组无显著性差异。当双低菜籽粕蛋白替代豆粕比例在25,,75,时，异育银 鲫和团头鲂的摄食率逐渐上升，但当豆粕替代率高达100,或替代饲料中全部的豆 的研究结果基本相同，他们认为，斑点叉尾鲴饲料中菜籽粕含量为31,或替代饲 料中50,的豆粕蛋白时，对其摄食没有影响，但菜籽粕含量在42(6,以上时，由 于饲料的适口性差，其鱼体增重率和摄食量显著降低。Higgs等 1982 对大麻哈 为合理，当饲料中25,的蛋白由其替代时，生长率、饲料或蛋白利用率显著下降; d， 用含菜籽粕0,、8(04,、16(1,、24(1,和32(15,的配合饲料喂养草鱼苗28 用折线法求得最适宜含量，结果以菜籽粕含量14(49,时为最佳。当然，饲料中双 低菜籽粕最佳添加量的确定与受试鱼的品种、体质、规格、饲料加工方法等多种 因素有关。 1(2(3(2硫苷对鱼类鱼体组成的影响 鱼类鱼体组成的改变，特别是必需氨基酸的沉积率与饲料中氨基酸组成分布 5 草鱼“肝日q综合症”病理变化及菜籽孝n对其肝脏毒性的研究 平衡有关，但也不排除是由于硫苷及其代谢毒物的某些作用造成吸收利用效果的 改变而导致的可能。随着饲料中双低菜籽粕蛋白替代比例的提高，异育银鲫 和团 头鲂鱼体的干物质、蛋白质、脂肪含量呈下降趋势，但与对照组相比无显著差异 尸 O(05 ，当双低菜籽粕蛋白替代豆粕蛋白的比例为100,或替代饲料中全部的 豆粕和鱼粉蛋白时，二者的脂肪含量显著下降，低于对照组;氨基酸总量和必需 氨基酸含量随着双低菜籽粕蛋白替代比例的增加略有下降，但各实验组与对照组 奥尼罗非鱼体组成研究表明，18,和12,豆粕组罗非鱼体蛋白的含量均显著高于 6,和无豆粕组 尸 0(05 。罗非鱼干物质、粗脂肪和粗灰分含量在组间差异不显著 尸 O(05 。菜籽粕、棉籽粕 菜籽粕:棉籽粕 2:1 不同替代水平罗非鱼的肝脂 含量、肝体比以及脏体比在组间差异均不显著 pO(05 林仕梅等，2007 。 1(2(3(3硫苷对鱼类内脏器官的影响 含有一定浓度硫苷的食物通过被鱼类摄食，会造成甲状腺组织形态上的改变 以及甲状腺激素分泌水平变化，同时也会不同程度地影响肝脏的结构及其功能。 auratus 的 食物中总硫苷的含量在O(22(2(181amol,g饲料时不会影响真鲷 Pagrus et 甲状腺激素的水平 Glencross a1(，2004a,b 。当虹鳟 Oncorhynchusmykiss 投 喂含硫苷量为1(4(19(39mol儋的饲料时，可以观察到其甲状腺组织学上的明显改变 Burelet 的水平，因此，食物中总的硫苷含量，即安全上限应该控制在1(4umol,g饲料，即 et 使这样也仍可能导致低水平的甲状腺肿大 Burela1(，2000b 。菜籽粕和棉籽粕 的用量为58,时血清GPT、GOT酶活力显著升高，表明罗非鱼的肝功能已受到 为30(O,时，在其肝脏切片中发现草鱼肝脏细胞结构遭受破坏，从而使肝脏不能 发挥正常生理功能。高含量的菜籽粕会对草鱼的肝细胞造成结构破坏，并显著影响 et et 血液中T4水平 Ma al，2005 ，这已在大菱鲆 Burel et al，2000b 上得到证实。菜籽粕、棉籽粕中这些毒素和抗营养因子通过对肝脏和 甲状腺的影响来影响水产动物的生长。 6 华中农业大学2009届硕士学位论文 1(2(4硫苷的脱毒方法 各种各样的措施都被尝试用于去除或减少硫苷的含量，从而降低硫苷及其代 谢产物对动物机体的毒性作用。这些方法包括投喂前的硫苷的水解作用或分解作 用。化学方法和一些其它的处理方法也被用于克服硫苷对动物的毒性作用。 国内外菜籽粕脱毒的方法主要有:物理脱毒法，化学脱毒法及生物学脱毒法 三大类。物理脱毒法主要是钝化芥子酶，但近年来发现，硫苷本身并非无毒而且 动物体内的某些微生物也能分泌与芥子酶具有相同作用的酶，将硫苷分解成有毒 物质 Cheng等，2004 。化学脱毒法主要有酸碱降解法、金属盐催化降解法和溶 剂浸出法3种。其中国内外研究最多的是双液相萃取法。该法由加拿大Rubin和 Diosady等开发，脱毒率可达90,以上，但干物质损失大、成本高、有三废 污染， 因而推广困难 张宗舟，2002 。生物学脱毒法主要有酶催化水解法、微生物发酵 法。催化水解法主要是利用外加芥子酶及酶的激活剂 如Vc等 ，使硫苷加速分 解，然后通过汽提或溶剂浸出以达到脱毒的目的 魏品石等，2000 ，该法不能脱 除植酸和多酚类化合物，加上芥子酶来源困难，而且脱除硫苷及其降解产物的过 程复杂，成本过高，因而不能大规模工业化生产。微生物发酵法是利用微生物直 接分解毒物，与其他方法相比，该法具有条件温和， 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 过程简单，干物质损失 小等优点。刘军，朱文优 2007 通过单菌株、多菌株生料固态通风发酵试验， 研制出了低硫代葡萄糖苷、高蛋白含量的菜籽粕发酵饲料，其硫苷含量为 根据油菜籽饼 粕 的抗营养因子的性质 即溶解性、对热不稳定性、在碱、微 生物的作用下转化为无毒的化合物 ，总结归纳了菜籽粕抗营养因子处理方法包 括:?坑埋法，可使油菜籽饼 粕 中的异硫氰酸残留量控制在0(05,以下，嗯 唑烷硫酮控制在0(02,以下，能较大程度使油菜籽饼 粕 中的营养物质不被破 坏，抗营养因子除去率可达90,，而粗蛋白损失仅3,左右;?水蒸煮法，处理后 嗯唑烷硫酮的含量减少84,，异硫氰酸酯含量减少了77,，抗营养因子去除率可 达80,。菜籽粕中的蛋白质品质由于其消化性质的改善而得到提高;?添加化学 制剂法，有烧碱、纯碱、氨和O(5,FeS04等，抗营养因子去除率达94,以上;? mol,L 发酵中和法，可使抗营养因子去除率达99,以上;?溶剂萃取法:用O(1 NaOH乙醇溶液、85,甲醇水溶液或70,的丙酮水溶液，均能有效地除去菜籽饼 7 草鱼“肝胆综合症”病理变化及菜籽材I对其肝脏毒性的研究 粕 中的抗营养因子;?焙炒法:‘置粉碎的菜籽饼 粕 于锅中，温火焙炒30 min左右，同时不断翻动，至散发出扑鼻香味，然后掺入0(5,的食盐，搅拌均匀 即可作饲用。 1(3研究目的 对鱼病的研究主要集中在因细菌、病毒和寄生虫等感染容易造成鱼类死亡的 疾病方面，而对鱼类的代谢疾病甚少关注。目前对于“肝胆综合症”尚未开展系统 研究，关于其流行病学调查、病理特征及成因均属空白。从而使得该病的防治技 术无法有效实施，相关治疗手段与用药方法也缺乏有效的理论依据。众所周知， 肝脏作为动物的代谢和解毒器官，其健康状况对动物的生长、代谢及抗病力均产 生重大影响。鉴于此，有必要对“肝胆综合症”这一类疾病进行综合研究。本实验 选择投喂不同配合饲料的草鱼养殖池塘进行取样，先通过肝脏外观和质地判断草 鱼“肝胆综合症"的发生情况，在此基础上对草鱼的生化指标进行分析，并对其 肝组织进行切片观察，从生理和病理的角度探讨草鱼“肝胆综合症”特点，并采用 营养学和毒理学相结合的方法，研究菜籽粕中的主要抗营养因子对草鱼肝细胞的 影响。为鱼类肝胆综合症的成因分析和有效防控提供一定的理论参考。 8 华中农业大学2009届硕十学位论文 第二章“肝胆综合症”草鱼血液生化特性及组织结构变化 随着集约化养殖的发展，养殖密度极大地提高，水体环境恶化日趋严重， 强 化投饲和营养成分的失衡以及饲料中含有毒物质等因素 潘连德，1999 ，造成鱼 病频发，药物用量加大，大大加重了鱼类肝脏的解毒负担，造成了对鱼类肝脏的 损害。目前，池塘养殖的草鱼、鲫等鱼类普遍存在着不同程度的肝脏损伤，鱼体 表面没有明显的症状，体色和体形无明显改变，解剖后会发现肝脏颜色发生变化， 呈绿色或花斑状，质地易脆 孟祥林和丁庆秋，2004:喻运珍等，2006 ，俗称“肝 胆综合症”。 目前对于这种肝脏病变现象尚未开展系统研究，关于其流行性调查及成因均 属空白，从而使得其防治技术无法有效实施。本实验选择肝脏外观正常和产生变 化的池塘养殖草鱼进行研究，对其血液生化指标进行比较分析，并对比观察其肝 脏组织学特征，从生理和病理的角度进行比较分析，为草鱼肝脏病变的成因分析 和有效防治提供一定的参考。 2(1材料与方法 2(1(1试验用鱼 idellus 精养池塘 每个渔场3口塘 。经事先调查，两渔场水质良好，符合国家 渔业水质 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，采样前一个月均未有用药记录。分别于2007年8月31日和9月3 日在每口塘中撒网捕鱼，随机采集体表正常、平均体重lkg左右的草鱼各 3尾。 2(1(2鉴别分组 经常规疾病检测判定所采集鱼体均未有因细菌、病毒和寄生虫等感染而引发 述，解剖鱼样观察肝脏表观判断，分别将外观相对正常的鱼和变化明显的鱼设定 为正常组和肝脏病变组。 9 草鱼“肝月H综合症”病理变化及菜籽粕对】e肝脏毒性的研究 2(1(3样品的采集 样品从尾静脉采血，每尾鱼采血5mL，分装于2mL离心管中，置于碎冰中 O? 标测定。将取完血的草鱼解剖，取部分肝脏用波恩氏液固定，用于制作组织切片， 其余部分置于5mL离心管中并用液氮速冻，于(80?下保存待测肝脏糖原和脂肪含 量。每尾鱼所采集的样品单独存放，作为一个样本。 2(1(4生化指标测定 限公司，其它试剂盒均购自中生北控生物科技有限公司:过氧化物歧化酶 SOD， 批号:20070808 采用分光光度法按试剂盒的说明测定，试剂盒为南京建成生物 科技有限公司生产。 2(1(5肝脏糖原与脂肪含量的测定 精确称取样本100mg，采用葸酮法 阴文娅等，2004 测定肝脏中糖原，每 一样本测定2个平行样;精确称取样本50rag，采用氯仿一甲醇抽提法 王少文等， 1993 测定肝脏脂肪含量，每一样本测定2个平行样。 2(1(6肝脏组织结构变化观察 样本经酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片 6岬 ，H(E染色，中性树 胶封片，在显微镜下观察。 10 毕中农业大学2009届顽?学位论文 21 7统计分析 生化指标试验数据采用STATISTICA60进行t(榆验统计分析 a O(05 2(2结果 2(2(1病变肝脏与正常肝脏形态比较及判定 解剖后经肉眼观察，18样本中，12尾鱼的肝脏颜色鲜艳，形杏、质地 正常 图 2la ;6尾为肝脏病变组 其中4尾来自大冶五湖渔场，2尾来自排湖渔场 ，其 肝脏颜色变浈，发黄 图2(1b ，部分肝脏呈淡绿色 图2lc ，质地较脆。 图2(1患病草鱼和对照草鱼肝脏外观图 andcontrols Fig2(1Morphologyoftheliverindiseasedgrasscarp 2(22草鱼病变肝脏组织结构 正常组肝脏If|L管嘲清晰，分布丁F常，H1:细胞细胞膜和细胞核均 清楚 见图2(2 a :病变组肝细胞细胞核偏移，部分细胞核溶解，发生一定程度的空泡变性 见 圈2(2b，d，e ，并见局灶性坏死 见图2(2c，f ，无法辨认肝脏细胞的核膜和核仁， 部分肝细胞已经胀亡。 4鱼“肝船综?症嘲,变化,菜籽粕埘其R脏毒性的研 究 圈2(2肝脏病变草鱼和健康草鱼肝韭显微结构 2(2 liverin withdiseasedHverandcontrols Fig ofthe Histology grasscarp x400;叫000 i 性 2 (细胞核溶解 3 HE染色(x200i o，f肝细胞细胞形态、核膜和 核仁无法辨认 4 ，部分细胞J怅亡 5 HE染色，x200;×1000 oftheliverin aHistology healthygrasscarpfIIE，x200 :b，d(eHcpatocyte vacuole 2 anddissolved 3 were 1 ，fatty kamn and?uckoluscannotbe necrosiswas membrane id朋tified 4 ，and respcctlvely :c，fHepmocyte observed 5 tiE(×200;。1000，respectively 12 华中农业大学2009届硕十学位论文 2(2(3病变组和正常组草鱼血清生化指标比较 健康草鱼和肝脏病变组草鱼其血清相关生化指标测定结果见表2(1。 2(2(3(1糖类、脂类以及蛋白质代谢产物含量的比较 2(2(3(2总胆红素、直接胆红素含量 总胆红素和直接胆红素均显著升高 P 0(05 。 2(2(3(3血清中肝脏相关酶类的比较 U ,L 肝脏正常组草鱼，其血清ALT活性值在11U,L--,25U,L之间，AST在89(81 ,343(7 U,L之间，ALP在75U,L,86U,L，而肝脏病变组草鱼，其血清ALT活性值 U,L,30 U,L--,252 U,L。 在20 U,L之间，AST在358(9U,L之间，ALP在69U,I_广96 与正常组比较，肝脏病变组血清中ALT、AST活性均呈极显著性升高 P O(03 ， ALP活性无显著性差异 胗O(05 。 2(2(3(4血清中SOD、补体C3、C4的比较 肝脏正常组草鱼，其血清SOD活性值在109(06 U,L,227(75U,L之间， 补体 C3含量在0(23g,3-4 (88 g,l 13 草鱼“肝月【l综含症”病理变化及菜籽丰fI对】e肝 脏毒性的研究 差异 尸 0(05 。 表2(1病变和正常草鱼血清相关生化指标的比较 平均值4-标准差 between with Table2(1 ofserumbiochemicalindices grasscarp Comparison diseasedliverandcontrols Mean士SD 项目 对照组 病变组 显著性 Item Control Diseased group groupSignificance 4(414-0(35 as 胆固醇CHO mrnolH 4(07+0(71 5(224-1(68 6(404-1(84 as 血糖GLU retool,1 甘油三酯TG mmol,1 3(274-0(07 4(06+0(05 宰 ? ? 肌酐CRE 1maol,1 23(95+4(6329(03+5(22 尿素氮BUN mmol,1 1(40-a:0(33 1(46-土0(23 as 总蛋白TP 鲋 28(60士2(1035(67+5(87 ns ? 直接胆红素DB i山mol,1 11(08+1(9716(80-士2(29 总胆红素TB grnol,1 11(79士 1(9436(17+24(97 ?? ? 12(984-18(28 188(544-52(95 天冬氨酸氨基转移酶AST U,L l ? 丙氨酸氨基转移酶?岍 U,L 16(10-3:4(2324(00-士4(55 碱性磷酸酶ALP U,L 79(004-6(0884(334-13(87 ns 0(42士0(10 ns 补体C3 酊 0(434-0(22 0(30-士0(07 ns 补体C4 鲫 0(354-0(12 木 190(79-3:44(90134(82+29(96 超氧化物歧化酶SOD nU,m1 注:搴表示呈显著性差异 尸 O(05 ;??’-表示呈极显著性著异妒 O。O】 ;IIS表示无显著性 差异 胗O(05 。 Note:?’’means difference 尸 significantdifference俨 O(05 ;衅"meansextremelysignificant 0(0 no difference俨 o(05 ( 1 ;‘'ns”meanssignificant 2(2(4病变组草鱼肝脏中脂肪、糖原含量变化 14 华中农业大学2009届硕士学位论文 表2(2可见，病变组草鱼肝脏中的脂肪含量呈上升趋势但不显著 JP 0(05 ， 其肝 脏中糖原的储备量则显著下降 P 0(05 。 表2(2病变和正常草鱼肝组织脂肪和糖原含量的比较 湿重含量，平均值 4-标准差 levelsin Table2(2 of and liverbetween with Comparisonlipid glycogen grasscarp diseasedliverand fresh controls in weight，Mean士SD 项目 对照组 病变组 显著性 Items Control Diseased group groupSignificance 脂肪Fat , 12(13士4(38 12(58+3(82 l'IS 5(38士0(92 4(27士1(071 ?? 肝糖原Glycogen , 注:??表示呈显著性差异;as表示无显著性差异 Note:“"means nO difference妒 O(05 ;“as” meanssignificantdifference 尸 0(05 ( significant 2(3讨论 血液与机体的新陈代谢有着密切的关系，且脏器外血管中血液与脏器内 血管