新分离的两株EV71病毒基因特征分析

新分离的两株EV71病毒基因特征分析 新分离的两E株V7 1病毒基因特征分 析 1 1 1 2 1 1朱明 , 郑锦绣 , 程险峰 , 董晨 , 陈瑾 , 詹圣伟 ( )11安徽省马鞍山市疾病控制与预防中心 , 安徽马鞍山 243000; 21东南大学临床医学院 , 南京 210009 ( ) ( [摘要 ] 目的 :了解安徽马鞍山 市 肠 道 病 毒 71 型 EV71 基 因 型 的 分 布 状 况 。方 法 : 利 用 逆 转 录 半 巢 式 PCR R T - )nPCR 的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 检测马鞍山地区 40份临床诊断为手足口病患儿的血清和咽拭子标本 。结果 : 40 份标本中检测到 2 份阳性 EV71 RNA ,检出率为 5 % ;经过测序证实 2份标本均为 EV71 C型 。结论 :马鞍山地区手足口病主要由 C型 EV71病毒引 起 ;利用生物信息学软件对这 2份标本的核苷酸同源性进行比较 ,发现 C型 EV71存在一定的变异 。 [关键词 ] EV71; R T - PCR; 手足口病 ; 基因型 ( ) 文章编号 ] 1004 - 8685 2009 03 - 0594 - 03 [[中图分类号 ] R373 [文献标识码 ] A Ana ly s is of two EV71 gen o type s in M aan shan A rea 1 1 1 2 1 1 ZHU M ing, ZH EN G J ing 2x iu, CH EN G X ian2feng, DON G Cheng, CH EN J in, ZHAN G S heng2w ei ( 11M aan shan Cen te r fo r D isea se Con tro l and P reven tion, M aan shan 243000, Ch ina; 21M ed ica l Co llege of Dongnan U n ive rsity, )N an jing 210009, Ch ina [ A b stra c t] O b jec t ive: To inve stiga te the EV71 geno typ e s in M aan shan a rea1M e thod s: EV71 RNA wa s de tec ted in 40 samp le s ( ) from the ho sp ita ls w ith reve rse tran sla tion po lym e ra se cha in reac tion R T - nPCR 1Re su lts: The re we re on ly 2 po sitive p roduc ts, po sitive ra te wa s 5 % 1A fte r the 2 po sitive p roduc ts we re sequenced, the re su lts showed tha t they we re of C geno typ e EV711C on c lu s ion : It seem s tha t the H FMD a re m a in ly infec ted by the C geno typ e EV71 in M aan shan a rea1The sequence comp a2 rision s of the po sitive p roduc ts show homogeneou s no t ve ry h igh1Th is ind ica ts tha t the cu rren t C geno typ e EV71 va rie s sign ifican t2 ly1 [ Key word s] EV71; R T - nPCR; H and - foo t - mou th d isea se; Geno typ e ( ) 肠道病 毒 71 EV71 型 是 小 RNA 病 毒 科 肠 道 病 毒 属 成 EV71 诊 断 试 剂 盒 面 世 , 因 此 利 用 由于目前还 没 有 相 关 员 ,自 1974年首次报道以来 , EV71 已经在世界范围内引起十 R T - PCR 法对 EV71进行检测有利于早期诊断 。我们利用逆 ( )多次爆发与流行 ;自 1997 年以来 , EV71 病毒的流行在亚太地 转录 - 半巢式聚合酶链反应 R T - nPCR 对马鞍山地区 40 例 区呈上升趋势 。 2008年 3月到 4 月间安徽省阜阳市发生儿童 手足 口 病 疑 似 患 儿 的 血 清 及 咽 拭 子 标 本 进 行 EV71 RNA 检 感染 EV71疫情 ,截止至 5 月 15 日 ,全国约 7 个省市共 25000 测 ,对其中的 2份 R T - nPCR 阳性产物进行测序 ,并与已知的 名儿童发病 ,其中死亡人数达到 36 人 。此次 EV71 感染症状 基因型代表株进行比较 ,发现马鞍山地区 EV71 感染为 EV71 ( ) C4型引起 ,而且型之间存在一定的变异 。轻者表现 手 足 口 病 hand foo t and mou th d isea se, H FMD 、腹 泻 、皮疹 、无菌性脑膜炎 、脑炎 、心肌 炎 , 严重者 表现为急性弛 [ 1 ] 缓性瘫痪 、全脑炎 、肺水肿或出血等 。 1 材料与方法 [ 2 ] 1999年 B rown等对来自美国和另外 5 个国家的 113 株111 EV71代表株和序列 EV71进 行 了 分 子 流 行 病 学 研 究 , 根 据 V P1 序 列 的 差 异 , 将 从 GenB ank中获取 10株 EV71的 V P1核苷酸序列 ,其中 2 EV71分为 A、B、C三型 ,同时 B 型和 C 型又分成 B1 和 B2 以 株 EV71为全基因序列 , 8 株为 EV71 部分基因 序列 , 包括 A、 及 C1和 C2两个亚型 。各地流行的病毒株不同 , 1970 年在加 B、C型及其亚型 。 ()利福尼亚分离的 EV71原型株 B rC r - Ca - 70属于 A 型 ; 1972 112 临床标本来源 根据卫生 部 发 布 的《手 足 口 病 预 防 控 制 - 1988年在澳大利亚和美国以及 1994 年在哥 伦比亚分离的 ( 指 南 》2008 年 EV71毒株属于 B 型 。 1997 - 2000年在新加坡 、马来西亚以及 ) 版 ,收集 2008年 5月至 2008年 7月马鞍山市人民医院 、妇帅 [ 3 ] [ 4 ]台湾流行的 EV71属于 B3、B4、C1和 C2 型 。崔爱利 等研 保健医院收治的临床诊断为手足口病患儿的血清和咽拭子标 究发现 ,中国大陆在 1998 ,2003 年间广泛的传 播 EV71 病毒 本共 40份 。 以 C3和 C4型为主 。 113 引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 根据 GenB ank中已知的 EV71核苷酸序列 ,利用不同的基 ( ) [作者简介 ] 朱明 1967 - , 男 , 本科 ,主管检验师 ,主要从事分 因型以及亚型的保守区合成的一组通用性引物 ,引物序列为 : 子流行学方面研究 。 第一 轮 : 5′- GTTCTTAACTCACA TA GCA - 3 ′, 5′- CCR GTA G2 GKGTRCACGCRAC - 3′; 第 二 轮 : 5 ′- GTTCTTAACTCACA T2 ;而本 实 验 中 所 得 的 2 例 阳 性 标 本 与 来 自 韩 国 、台 基因 ?型 A GCA - 3 ′, 5′- TTGACAAAAACTGA GGGGTT - 3 ′。引 物 位 于湾 、深圳等地的 6例基因 ?型毒株形成一个较大分支 ,提示这[ 5 ] 2份标本均属于 C型 EV71。在 C 型 EV71 这一主分支中还可 EV71 V P1区域 ,能有效的扩增 EV71 A、B、C的基因片段 。 114 RNA 抽提及半巢氏 R T - PCR 检测以分 为 4 个 亚 分 支 , 代 表 4 个 不 同 的 基 因 亚 型 , 其 中 (病毒单正链 RNA 基因组的提取按照 R nea sy M in iKit Q IA A F1359346和 A F376120 2 例 毒 株 形 成 一 个 亚 分 支 , 为 C1 亚 )μCa ta log 74104 操作说明进行 , 取 100 l 病毒分离悬液 ,按试 型 ,台湾 2株形成一个亚分支 ,分别为 C2亚型 ;韩国 2株为 C3剂盒 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 步骤操作 。所提取 RNA 贮于 - 70 ?或立即进行反 型 ,马鞍山 2株和深圳 2株共同组成一个分支 ,为 C4亚型 。转录反应 。 μ实验设阴性对照 , R T - PCR 反应采用 50 l反应体系 : 病 表 1 马鞍山地区 2例 EV71毒株与各代表株核苷酸同源性的比较 ( %) μμμ毒 RNA 4 l, 5 × Green buffe r 10 l, M gc l4 l, dN TP 2 ( μ( μμ) ) 215 mmo l /L 4 l,上游引物 100 g /m1 ll, Taq DNA 聚合 (() ) 酶 购自 P rom ega215 U , AMV 逆转录酶 购自 P rom ega10 U , () μRN a sin 购自华美 25 U ,加 HO 到 50 l。 2 逆转录反应条件 : 42?逆转录 45 m in, 94 ?预变性 4 m in; 第一轮 PCR 反应条件 : 94?变性 30 s, 50 ?退火 25 s, 72?延 伸 70 s,共 32 个循环 ; 72 ?再延伸 10 m in。第二轮 PCR 反应 条件 : 50 ? 30 m in, 94 ? 2 m in, 94? 30 s, 48? 30 s, 72? 40 s, 30 个 循 环 。琼 脂 糖 凝 胶 回 收 : 按 TaKaR a A ga ro se Ge l DNA Pu rifica tionKitV e r210说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作 。 115 序列的测定和分析 将 PCR 阳性产物由上海英骏生物公司完成序列的测定 。 采用分子生物学软件 DNA STAR 软件包进行序列的同源性比 [ 6 ] 较及基因进化树的绘制 ,方法参照文献 。 2 结果 211 EV71 RNA 的检测图 2 基于 EV71 VP1 区域的基因进化树及基因分型 应用半巢氏 R T - PCR 的方法 ,选择 EV71不同型的通用性 引物对马鞍山地区临床诊断为手足口病患儿的 40份血清和咽 3 讨论 拭子标本进行 EV71 RNA 检测 ,结果有 2份标本阳性 ,阳性率为 EV71病毒是在 1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经 [ 6 ] 5% 。图 1是阳性标本 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图谱 。系统疾病的婴儿的粪便标本中分离出来的 。此后许多国家 相继报道了 EV71 的流行情况 ,在过去 30 多年间曾经发生过 三次大流行 。 1998 年 6 月 至 10 月 我 国 台 湾 地 区 的 流 行 中 129106例发生了手足口病 ,其中严重病例 405 例 ,死亡 78 例 , 83 % 死于肺水肿或出血 , 91% 的死亡患儿小于 5 岁 。在台湾 [ 3 ] 分离出病毒的病人中 , EV71分离率为 4817 % 。 由于 EV71和 CoxA16为 H FMD 主要病因 ,但无法根据临 床症状区分 ,病因的确定有赖于实验室诊断 。 EV 感染的实验 室常规诊断方法为病毒分离 、恢复期和 急性期中和抗体检测 及免疫组化法 。这种方法费时 、费力 ,不能满足疾病流行期间 [ 7 ] 标本量大和快速诊断的要求 。研究证明 EV 的 V P1 基因序 列与病毒血清型相关 ,可用于鉴定 EV 血清型 ; 并有最大的变 11MA12; 21MA18; 31DNA 分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ; 41阴性对照 异速率 ,可进行同源性进化分析 ,用于分子流行病学研究 。 图 1 马鞍山地区标本的 PC R产物电泳图本研究用 EV71特异性引物 ,进行半巢氏 R T - PCR 法 ,扩 212 基因分型增出 V P1区部分基因片段 ,可达到快速诊断的目的 。此研究 将 2份马鞍山阳性标本的 PCR 产物纯化后测序 ,并将所 扩增的目的 片 段 为 232 bp , 用 于 检 测 40 份 血 清 和 咽 拭 子 标 获得的核苷酸序列与 EV71 各基因型以及亚型代表株的相应 本 ,结果有 2份为 EV71阳性标本 。并对 2株病毒的特异性基 区进行段比较 。由表 1 可见 ,这 2 株 EV71 分离株与 A、B 基因片段进行了基因进化分析 ,结果发现 , 2 株病毒与 A、B 基因 因型代表株比较差异较大 ,与 A 型代表株 U22521 核苷酸序列 型代表株比较 差 异 较 大 , 与 C 型 的 同 源 性 接 近 , 尤 其 与 属 于 同源性为 7913% ,8013% ; 与 B 基因型代表株 A135885 核苷 C4亚型的中国大陆 SH ZH98有最近的进化关系 。 酸序列同源性为 7717 % ,7818% ,与 C4 亚型代表株具有较高 B rown等研究 ,认为各基因型内部的差异基因型内部差异 () 的同源性 ,为 8616 - 8916% 。从基因进化树 图 2 可以看到 , 在 1615 % ,1917 %之间以及小于 12 %为分型和分亚型的标 U22521株构成一个主要分支 ,代表基因 ?型 ; A135885 株则为 () 下转第 657页 帄已经处于适宜水帄 。 ,提高出生人口的智力水帄 。 娠期妇女科学补碘 甲状腺激素水帄反映了甲状腺 的功能状况 , 本研究主要 [参考文献 ] 检测了甲状腺功能相关指标 TSH、FT4、FT3,结果显示 : 城市与 农村妊娠妇女 TSH 水帄之间差异无显著性 ,城市与农村妊娠 [ 1 ] 阎玉芹 ,陈祖培 1孕妇和哺乳妇女的碘营养及其监测 [ J ] 1 中国地 妇女 FT4和 FT3水帄之间差异有显著性 。我们参照阎玉芹等 ( ) 方病学杂志 , 2004 , 23 3 : 276 - 2781人的正常孕妇甲状腺激素水帄的参考值范围来评价本次调查 [ 2 ] 阎玉芹 ,董作亮 ,董玲 ,等 1正常妊娠不同孕期的甲状腺激素参考 的妊娠妇女 ,结果发现该次调查的 304 例妊娠妇女中 TSH 指 ( ) 值范围 [ J ] 1中华内分泌代谢杂志 , 2008 , 24 6 : 609 - 6121 标异常 919% , FT4 指标异常 1315 % , FT3 指标异常为 1415 % , 甲状腺激素指标异常者农村高于城市 。进一步分析发现 , 农 [ 3 ] 陈祖 培 1 尿碘的 测定 及其临 床意 义 [ J ] 1 中 国地 方病学 杂志 , () 村妊娠妇女低甲血症者 低 FT4 血症 的比例明显高于城市 。 ( ) 1997 , 16 1 : 35 - 371 提示农村妊 娠 妇 女 更 易 发 生 低 甲 血 症 等 甲 状 腺 功 能 异 常 状 [ 4 ] W HO Techn ica l Con su lta tion: Iod ine requ irem en ts in p regnancy and 况 。 ( ) infancy1 IDD N ew sle tte r, 2007 , 23 1 : 1 - 21 虽然城市与农村妊娠妇女尿碘 水帄没有差异 , 但在该课 [ 5 ] 王仁禹 ,郭先池 ,徐明珠 ,等 1全民普食碘盐对育龄 、妊娠和哺乳妇 题调查中发现城市妊娠妇女在饮水种类和合格碘盐食用率上 ( ) 女尿碘水帄的影响 [ J ] 1 中国地方病学杂志 , 2003 , 22 4 : 351 -均明显好于农村 ,城市妊娠妇女日常海产品摄 入次数明显高 2 3521 (χ) 于农村 = 16195 , P = 0100 。碘在人体内的 吸收利用主要 [ 6 ] 胡边 ,蒋继勇 ,杨子更 ,等 1新疆和田地区孕妇和婴帅儿碘营养水 受膳食 蛋 白 质 营 养 供 给 和 环 境 水 源 中 高 氟 低 硒 等 因 素 影 [ 6 ] ( ) 帄调查分析 [ J ] 1中国优生与遗传杂志 , 2005 , 13 9 : 45 - 481 响 ,同时又受 经 济 水 帄 和 文 化 、饮 食 习 惯 等 多 种 因 素 的 影 [ 7 ] Pop VJ , B rouwe rs EP, V ander HL , et a l1M a te rna l hypo thyroxinaem ia 响 ,农村妊娠妇女生活水帄和经济收入低于城市 ,城市妊娠妇 女更重视孕期各种蛋白质和碘营养物质及注重饮食结构合理 du ring ea rly p regnancy and sub sequen t ch ild deve lopm en t: a 3 - yea r 性 ,致使城市妊娠妇女 TSH、FT4、FT3水帄高于农村 ;农村妊娠 ( ) fo llow - up study[ J ] 1C lin Endoc rino l, 2003 , 59 3 : 282 - 2881 妇女中甲状腺激素指标异常的比例显著高于城市 。国外的几 [ 8 ] M itche ll ML , Kle in R Z1The sequelae of un trea ted m ate rna l hypo thy2 项研究已证明妊娠妇女孕期发生亚甲减或低 FT4 血症可使胎 ( ) ro id ism [ J ] 1Eu r J Endoc rino l, 2004 , 151 Supp l 3 : U45 - 481 [ 7,9 ] 儿的神经系统发育受到损害 ,且母亲在妊娠期的 TSH 和 [ 9 ] H addow JE, Pa lom ak i GE, A llan W C, et a l1M ate rna l thyro id defic ien2 FT4水帄与 胎 儿 的 精 神 运 动 和 智 力 发 展 有 着 非 常 重 要 的 关 cy du ring p regnancy and sub sequen t neu rop sycho logical deve lopm en t of [ 10 ] 系 ,因此及时筛选出甲状腺激素异常者至关重要 。为了减 ( ) the ch ild [ J ] 1N Engl J M ed, 1999 , 341 26 : 549 - 5551 少残疾儿童的出生率 ,提高胎儿的智力发育 ,农村妊娠妇女更 [ 10 ] Travers CA , Gu ttikonda K, No rton CA , et a l1 Iod ine sta tu s in p reg2 需在食用碘盐的基础上 ,提高膳食结构的合理性 ,特别要增加 nan t wom en and their newbo rn s: a re ou r bab ie s a t risk of iod ine defi2 ( ) c iency? [ J ] 1M ed J A u st, 2006 , 184 12 : 617 - 6201 [ 11 ] 朱素娟 ,金行一 ,徐卫民 ,等 1杭州市妊娠妇女尿碘及甲状腺功能 ( ) 状况分析 [ J ] 1中华内分泌代谢杂志 , 2008 , 24 6 : 613 - 6151 () 收稿日期 : 2008 - 10 - 13 ()上接第 595页 [ 2 ] B rown BA , O be rste M S, A lexande r JP, et a l1Mo lecu la r ep idem io logy 准 。而我们 所 分 离 两 株 病 毒 与 C 型 同 源 性 仅 在 8319% , and evo lu tion of en te ro - viru s 7 stra in s iso la ted from 1970 to 1998 8916 %之间 ,应该属于一个新的型或亚型 ,但从基因树分析可 ( ) [ J ]. V iro logy, 1999 , 73 12 : 9969 - 99751 以看出 , MA12、MA18依然属于 C 型 , 考虑原因 为我们所扩增 [ 3 ] Ho M , Chen ER , H su KH , et a l1A n ep idem ic of en teroviru s 71 infec2 的片段较小 ,容易引起同源 性的较大差异 。目 前国内用于检 ( ) tion in Ta iwan [ J ] 1N Engl J M ed, 1999 , 341 13 : 929 - 9351 测 EV71的引物所扩增的序列均在 200 - 350 之间 ,而继续用 [ 4 ] 崔爱利 ,许文波 ,李秀珠 ,等 1 肠道病毒 71 型的 R T - PCR 诊断及 B rown的分型原则进行分型是否可行 ,值得商榷 。( ) 基因特征 [ J ] 1病毒学报 , 2004 , 20 2 : l60 - 1651 此次 EV71分离株与 C4亚型代表株具有最大的核苷酸序 [ 5 ] Ca rdo sa MJ , Pe re ra D , B rown B A , et a l1Mo lecu la r ep idem io logy of 列同源性 ,但同源性并不高 ,可能 C亚型之间发生了变异 。因 hum an en te ro - viru s 71 stra in s an d recen t ou tb reak s in the A sia - Pa2 此 ,我们应该加强对 EV71基因型和基因对应的编码蛋白变异 c ific region: comp a ra tive ana lysis of the V P1 an d V P4 gene s [ J ]. 情况的研究 ,这对研制灵敏度高 、特异性强的诊断试剂以及开 ( ) Em e rg Infec t D is, 2003 , 9 4 : 461 - 4681 发 EV71疫苗均有很重要的意义 。 [ 6 ] 陈国兵 ,孟继鸿 1戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定 ( ) 及基因型分型 [ J ] 1 中华微生物学和免疫学杂志 , 2004 , 24 10 :[参考文献 ] 828 - 8331 [ 7 ] W ang JR , Tsa i H P, Chen PF, et a l1A n ou tb reak of en teroviru s 71 infec2 ( ) [ 1 ] 仇桂华 ,何燕帄 , 刘艺颍 ,等 1 重症手足口病 EV71 感染 并发神 ( ) tion in Ta iwan 1998 [ J ] 1J C lin V iro l, 2000 , 17 2 : 91 - 991 ( ) 经源性肺水肿患儿的急救与护理 [ J ] 1 安徽医学 , 2008 , 29 4 : ()收稿日期 : 2009 - 01 - 11 367 - 3681