核磁共振技术及其在天然产物结构鉴定中的应用(河北医科大学学报,2006年04期)

·综　　述· 　　[收稿日期 ] 2005212215 ; [修回日期 ] 2006204212 [基金项目 ] 先正达研究基金 编号 : 20052Hebei Medical University2Syngenta201 [作者简介 ] 张嫚丽 (1978 - ) ,女 ,黑龙江五常人 ,河北医科大学 药学院助教 ,医学硕士 ,从事天然产物活性成分的研究。3 通讯作者 核磁共振技术及其在天然产物结构鉴定中的应用 张嫚丽1 ,史清文1 3 ,顾玉诚1 ,2 (综述) (1. 河北医科大学药学院天然药物化学教研室 , 河北 石家庄 050017 ; 2. J ealott’s Hill International Research Centre , Syngenta , Berkshire , RG42 6 EY , U K) 　　【关键词】　磁共振波谱学 ;天然产物 ;结构鉴定 ;综述文献 　　【中图分类号】　R927 　　　【文献标识码】　A 　　　【文章编号】　100723205 (2006) 0420314204 　　核磁共振 (nuclear magnetic resonance , NMR) 是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用 下 ,吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。该 现象早在 1946 年已被 Bloch 和 Purcell 等人用实验 所证实。NMR 现象的发现具有十分重要的意义 , 不仅为量子力学的基本原理提供了直接的验证 ,而 且为多个学科领域的研究提供了一种不可缺少的分 析与测试手段 ,特别是在复杂化合物的结构鉴定中 具有独特的优势。NMR 技术主要有两个学科分 支 :核磁共振波谱技术 ( nuclear magnetic resonance spect roscopy , NMRS ) 和 核 磁 共 振 成 像 技 术 (magnetic resonance imaging ,MRI) 。NMRS 是基 于化学位移的原理发展起来的 ,主要用于测试物质 的化学成分和分子结构。MRI 诞生于 1973 年 ,它 是利用磁场与射频脉冲使结构组织内氢质子运动产 生信号 ,经计算机处理而成像的 ,是一种无损害技 术 ,可以用于获取多种物质的内部结构图像 ,目前在 临床医疗诊断中得到了广泛的应用。 1 　NMR 的基本概念 NMR 是共振现象的一种 , 是指原子核在运动 中吸收外界能量产生的一种能量跃迁现象 ,这种现 象只能出现在相邻的两个能量之间。对氢原子而 言 , 在静磁场中处于两种基本能量状态 , 指向磁场 方向的原子核处于低能级 , 逆向磁场方向的原子核 处于高能级 , 由磁场和温度来决定两种基本能量状 态核子之间的动态平衡。将样品放入大磁场中 , 加 入与静磁场相交成一定角度的 , 并发射与该样品原 子核运动频率 (原子核在静磁场中按正确的角度旋 转频率 , 也称拉莫尔频率) 相同的射频脉冲 ( RF 脉 冲) , 即 RF 脉冲与拉莫尔频率相同时 , 质子磁矩会 吸收 RF 脉冲的能量 , 使磁矩从低能级跃迁到高能 级 , 称共振吸收。移去 RF 脉冲后 ,质子磁矩便从 高能级回到低能级 , 并将吸收的能量以电磁波的形 式发射出来 , 称为共振发射 ,此吸收与发射的过程 称为核磁共振。 2 　一维核磁共振谱 (1D2NMR)及其应用 在化合物的结构鉴定中最常见也是最基本的核 磁共振技术是一维核磁共振氢谱 (1 H2NMR) 和一 维核磁共振碳谱 (13 C2NMR) 。一维核磁共振氢谱 (图 1)提供的信息主要有化学位移 ,偶合常数 ,吸收 峰的裂分方式和氢原子数目。通过化学位移值可以 了解氢的偕碳是否有杂原子以及是 sp3 还是 sp2 碳 原子 ; 通过偶合常数的大小和吸收峰的裂分方式可 以了解一个氢与它的邻碳上的氢之间的两面夹角 , 判断化合物的构型和构象以及是否存在偕偶。在通 常的情况下 ,杂原子上的氢观察不到 ,但在丙酮和二 甲基亚砜中可以观察到羟基上的氢。如果通过高分 辨质谱获得了分子式 ,分子式中的氢数减去在核磁 共振氢谱中观察到的氢原子数目就是属于杂原子上 的氢原子数。一维核磁共振碳谱可以提供碳原子的 数目和碳原子杂化类型 (sp ,sp2 ,sp3) 以及是否连有 杂 原 子 ( 图 2 ) [1 ] 。 D EP T ( distortionless enhancement by polrization t ransfer) 谱 : DEP T 谱 是 IN EP T 法的一种改良方法。在实验中通过改变 照射1 H 的三个脉冲角度 (Q) ,使其作 45°、90°、135° 变化并测其13 C2NMR 谱 ,可以得到用以区别伯、仲、 叔、季碳的13 C2NMR 谱 (图 3) [ 2 ] 。NO E 差谱 :选择 地照射一种质子使其饱和 ,则与该质子在空间位置 上接近 (通常小于 5 ÜA) 的另一个或数个质子的信号 强度增高的现象被称为核 Overhauser 效应 ,简称 ·413· 第 27 卷第 4 期 2006 年 7 月 　 河 北 医 科 大 学 学 报 JOU RNAL OF H EBEI M EDICAL UN IV ERSIT Y 　Vol. 27 　No. 4J uly 　2006 NO E。NO E 主要用来确定两种质子在分子立体空 间结构中是否接近 ,若存在 NO E ,则 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示两者接近 , NO E 值越大 ,则两者在空间的距离就越近。利用 NO E 效应 ,可以用来确定分子中某些基团的位置、 立体构型、糖与糖及糖苷链与苷元的连接位置等 , 是研究立体构型和优势构象的重要方法。在有些情 况下 ,还可以利用 NO E 差谱来帮助推断化合物的 结构 ,特别是由于较多的季碳或杂原子相连 ,用碳氢 远程偶合无法判断时 ,可借助 NO E 差谱来完成碎 片的连接。下列两组化合物 (图 4) 通过简单的氢谱 和碳谱无法区别 ,但通过照射甲 (氧) 基或羟基上的 氢得到不同的 NO E 差谱 ,利用 NO E 差谱很容易把 二者区别出来。如照射化合物 A 的甲氧基时 ,对其 邻位的两个芳氢有 NO E 效应 ,而当照射化合物 B 中的甲氧基时 ,仅对其邻位的一个芳氢产生 NO E 效应 ,但同时异丙基上的一个甲基也产生 NO E 效 应 ,借此可以用来区别化合物 A 与 B。 图 1 　两个倍半萜内酯的1 H2NMR 谱及其结构 (500 M Hz , CDCl3) 图 2 　Curvicollide A 的13 C2NMR 谱及其结构 图 3 　(3 E , 7 E)22α,5α,10β,13α,202五乙酰基23 ,82裂分紫杉烷23 ,7 , 112三烯292酮的 DEP T 谱 (125 M Hz , CDCl3) 图 4 　两个异构体的结构式 3 　二维核磁共振谱 (2D2NMR)及其应用 二维核磁共振 (2D2NMR)是 20 世纪 70 年代提 出 ,80 年代初期发展起来的新技术。随着高频核磁 共振仪的出现 ,在 80 年代末和 90 年代初 ,二维核磁 共振得到了迅速发展 ,现已成为有机化合物结构鉴 定的常规分析方法 ,也为天然产物的结构鉴定带来 了一场革命。二维核磁共振实验是一维核磁共振的 延伸 , 在一维实验的脉冲过程中加入演化期 (evolution time) ,在每次实验中 ,将演化期按顺序 的逐次增加来获得数据 ,经两次的傅氏转换就可得 二维共振光谱。演化期增加的次数可达 100～1000 次 ,因此所需的时间 ,也是一维光谱的百倍至千倍。 在化合物的结构鉴定中常用的二维核磁共振技术主 要有同核氢2氢相关谱1 H21 H COSY(proton2proton correlation spect roscopy ) , NO ESY ( nuclear overhauser effect spect roscopy ) 和 RO ESY (rotating f rame overhauser effect spect roscopy) 以 及异核碳2氢相关谱 HSQC ( heteronuclear single quant um coherence) , 异核多量子相干谱 HMQC (heteronuclear multiple quant um coherence) 和异 核多键相关谱 HMBC (heteronuclear multiple bond correlation) 。同核氢2氢相关谱1 H21 H COSY 主要 用于确定氢谱中相互偶合的共振体系 (图 5、6) [3 ] 。 同核氢2氢相关谱 NO ESY 和 RO ESY 是二维的 NO E 差谱 , 图谱的形状和1 H21 H COSY相似 ,但它 的交叉峰指出的是在空间上比较接近的质子的信 ·513·河 北 医 科 大 学 学 报　　第 27 卷　第 4 期 息 ,一个 NO ESY 谱相当于数个 NO E 差谱所提供 的信息 ,已经取代 NO E 谱用来确定在立体空间上 比较接近的氢相互偶合的关系 ,提供有关分子相对 立体化学和溶液构象方面的重要信息。当用1 H21 H COSY谱进行结构解析遇到困难时 (如相邻质子间 二面夹角等于或接近 90°时 ,偶合常数等于零或受 多个季碳或杂原子阻隔) ,NO ESY 和 RO ESY 谱常 常能提供有用的信息 ,把分子中的原子或碎片构造 连接起来。异核碳2氢相关谱 HMQC 和 HSQC 是 碳2氢直接相关谱 ,可以用于确定每一个碳上含有的 氢原子数目。在具有多环体系的复杂天然化合物分 子中 ,一些环上的 CH2 结构单元上的两个质子一般 是不等价的。这种偕氢质子间的偶合2J H H 常常 和3J HH偶合混杂在一起 ,往往干扰质子偶合体系的 分析。HMQC 谱对这种不等价的孪生质子的分析 提供了有效的手段。同时 ,结合1 H21 H COSY 谱 , 为把质子与质子的偶合相关信息转便成碳原子与碳 原子的连接提供了基础。现在二维的 HMQC 和 HSQC 碳2氢直接相关谱基本已经取代了一维的 IN EP T 和 D EP T 用来区别伯碳、仲碳、叔碳和季碳 , 如在图 7 ,C22 ,C25 ,C29 和 C210 分别和一个氢有偶 合 ,说明 C22 ,C25 ,C29 何 C210 上连有一个氢 ,而 C2 20 则和两个氢有偶合 ,说明 C220 上连有两个氢[4 ] 。 异核碳2氢相关谱 HMBC 是一种远程的通过两个 键 ,三个键 ,甚至四个键的碳2氢相关谱 ,通过这种远 程的碳2氢相关谱可以把因有季碳或因有杂原子而 中断的氢2氢相关体系连接起来 ,如在图 8 中 ,52位 羟基上的氢同时和 C24 ,C25 ,C26 相偶合 ;132位羟基 上的氢同时和 C212 , C213 , C214 相偶合[4 ,5 ] 。异核 碳2氢相关谱 HMBC 还可以用于确定取代基的位置 如在图 9 中 , H210 如和乙酰基上的羰基碳相偶合 , 说明乙酰基位于 C210 位 , H210 如和苯甲酰基上的 羰基碳相偶合 ,则说明苯甲酰基位于 C210 位[6 ] 。 HMBC 还可以用于判断区别母核的骨架类型如在 图 10 中 ,如能观察到 H210 与 C21 和 (或) H214 与 C211 的远程偶合 ,说明 A2环是重排的五元环 ,如能 观察到 H210 与 C215 和 (或) H216 , H217 与 C211 的 远程偶合 ,则证明 A2环是正常的六元环[7 ] 。 4 　小 　　结 一维核磁共振 (1 H NMR 和 13C NMR) 和二维 核 磁 共 振 ( 1 H21 H COSY , NO ESY/ RO ESY , HMQC/ HSQC 和 HMBC) 是最基本的也是在化合 物的结构鉴定中最常用的核磁共振技术。一个化合 物的结构鉴定特别是一些结构比较复杂的天然产物 的结构鉴定通常需要上述几种技术和高分辨质谱 ( HR2MS , HR2FAB2MS)的配合才能完成其平面结 构的鉴定和立体化学的分析[8 ] 。近年来一些新的核 磁共振技术如 : HO HA HA [9 ] , 三维核磁共振 (3D2 NMR) [10 ] , 固相核磁共振和气相核磁共振[11 ] ,碳2 碳偶合[ 12 ] , 计算机技术[ 13～15 ] 等已经应用到化合物 的结构鉴定中 ,对于一些结构特别复杂的天然产物 的结构鉴定 ,还有一些比较特殊的核磁共振技术也 偶尔被应用[16 ,17 ] 。尽管核磁共振的灵敏度远远不 如质谱的灵敏度高[18 ] ,但现在0. 5 mg 以下的微量 样品的结构鉴定已经不再成为问题[19 ] 。新颖的低 温超导探头的应用将使 NMR 的灵敏度提高 3. 5～ 4 倍 ,可使原来需要一个小时的实验缩短为几分钟。 800 兆周以上的超高场超导核磁共振仪将在生命科 学研究领域特别是蛋白质的结构测定中发挥越来越 重要的作用。最近 ,美国科学家首次利用 NMR 技 术测定分子间的相互作用 ,并提出了用核磁技术研 究药物构效关系的概念 ,它所提供的信息将为小分 子药物的结构优化带来帮助[20 ] 。近 20 年来 ,新的 核磁技术不断被发明 ,相信在不久的将来 ,天然产物 的结构鉴定还将迈上一个新的台阶。 图 5 　52表加拿大烯的结构式 ,粗线表示自旋系统 ,箭头表示1 H21 H 远程相关 图 6 　52表加拿大烯的1 H2COSY谱 (300 M Hz , CDCl3) ·613· 河 北 医 科 大 学 学 报　　第 27 卷　第 4 期 图 7 　加拿大红豆杉中[ 3. 3. 3. ] [ 3 . 4 . 5 ]2二螺桨烷的 HMQC 谱 图 8 　加拿大红豆杉中[ 3 . 3 . 3. ] [ 3 . 4 . 5 ]2二螺桨烷的 HMBC 谱 图 9 　Taxuspine N 及其异构体结构 ,箭头表示主要的1 H213 C 远程 相关 ( H →C) 图 10 　重排紫杉烷及其异构体结构 ,箭头表示主要的1 H213 C 远程相 关 ( H →C) 【参考文献】 [ 1 ] 　Che YS , Gloer JB , Wickiow D T. 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