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race技术原理和操作 RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的 5'和 3'末端的...

RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的 5'和 3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5' 和 3' 端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohm 等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等 11999）。 an 对传统 RACE 技术的改进主要是引物设计及 RT-PCR 技术的改进：改进之一是利用锁定引物（lock docking primer）合成第一链 cDNA，即在 oligo(dT) 引物的 3' 端引入两个简并的核苷酸[5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条 cDNA链时oligo(dT)与poly(A) 尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在 5' 端加尾时，采用 poly(C)，而不是 poly(A)；改进之三是采用 RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热 DNA 聚合酶可能在高温（60℃~70℃）有效地逆转录 mRNA，从而消除了 5' 端由于高 CC 含量导致的 mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动 PCR （hot start PCR）技术和降落 PCR（touch down PCR）提高 PCR 反应的特异性。随着 RACE 技术日益完善，目前己有商业化 RACE 技术产品推出，如 CLONTECH 的 MarathoTM 技术和 SMARTTM RACE 技术。邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行 RACE 反应，结果发现使用 MarathonTM 所得到的片断总是比采用 SMARTTM RACE 试剂盒到所得到的片断短。其原因在于 MarathonTM 技术反转录反应往往不能真正达到 mRNA 的 5' 末端。所以认为，进行 RACE 反应应当优选 SMARTTM RACE 试剂盒。以下就国内目前应用最广的 SMARTTM RACE 试剂盒为例，简要概述 RACE 技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3'-RACE原理利用 mRNA 的 3' 末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有 SMART 寡核苷酸序列通用接头引物的 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物反转录合成标准第一链 cDNA。然后用一个基因特异引物 GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以 cDNA 第一链为模板，进行 PCR 循环，把目的基因 3' 末端的 DNA 片段扩增出来。（见下图） SMARTTM 5'-RACE原理先利用 mRNA 的 3'末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物在反转录酶 MMLV 作用下，反转录合成标准第一链 cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的 5' 末端时自动加上 3-5 个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以 SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物 2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以 SMART 第一链 cDNA 为模板，进行 PCR 循环，把目的基因 5'末端的 cDNA 片段扩增出来。最终，从 2 个有相互重叠序列的 3'/ 5'-RACE 产物中获得全长 cDNA，或者通过分析 RACE 产物的 3'和 5'端序列，合成相应引物扩增出全长 cDNA。实验中发现，做 RACE 反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对 RACE 反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为： 1. 在 5'-RACE 包含了有 3 个连续的酶反应步骤（反转录、同聚物加尾和 PCR 扩增），每一步都可能导致失败； 2. 扩增 DNA 末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增 DNA 模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用 RACE 技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除 RACE 实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。随着 RACE 的不断改进和完善，优化条件下 PCR 扩增效率和忠实性的提高及 PCR 产物克隆技术的迅速发展，RACE 必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。 RACE 的另一种代表方法-Self-Ligation 法反转录(RT)反应------Hybrid RNA 的分解------单链 cDNA 的自身连接 ------PCR扩增 5'未知区域------目的 DNA片段的切胶回收------DNA序列测定

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