流式细胞
检测
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的步骤【人乳腺癌贴壁细胞流式检测】一、细胞铺板调整细胞浓度2.5x105，加2ml培养液于六孔板中置于培养箱中过夜,铺两板，次日加药，分别作用24h和48h。分组设定：调补偿组：空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组实验组(FITC+PE组)：贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组实验组中每组检测两次.二、流式样品准备消化：选取处于对数生长期的细胞，收集旧培养基，培养基离心。离心完毕后，离心管中剩2ml液体。用来贴壁细胞的终止消化。贴壁细胞用200ul0.25%胰蛋白酶消化，消化5分钟，然后加2ml离心过的培养基终止消化。离心：800r/min,离心5min，弃掉上清液。重悬：加2mlPBS重悬，涡旋成单细胞悬液。将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去上清液。加300ulPBS重悬细胞。调补偿组：分别吸取贴壁细胞50ul细胞悬液于四个流式管中(此时细胞数至少为1x106/ml以上)，分成四组，即空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组。实验组((FITC+PE组)：贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组。实验组中每组检测两次，故每组分别吸取50ul细胞悬液于两个流式管中。空白对照组什么也不加，剩下的每组加相应的抗体10U1。常温避光孵育20min。孵育完成后，加lmlPBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。离心后垂直倒掉上清液，再加200ulPBS重悬细胞，进行上机检测。三、操作注意消化细胞时要让胰酶自然消化，最好不要人工拍打，否则会成片脱落，影响结果的测定。上机前的细胞最好是单细胞状态，不要粘连，以免对流式细胞仪造成损伤。垂直倒掉上清液后，不要再进行二次倾倒，以免将细胞倒掉。上机检测前，用锡纸把流式管包住，避光。实验设置空白对照组和贴壁细胞组加荧光染料前都是DMEM全培+贴壁细胞，只不过一个用于调补偿，一个用于实验检测。贴壁细胞组姜黄素40榄香烯50DMS0组姜黄素40榄香烯50【人乳腺癌悬浮细胞流式检测】一、细胞铺板选取第三代处于对数生长期的悬浮球细胞，以密度3x105接种于低粘附6孔板中，铺两板，次日加药，分别作用24h和48h。分组设定：调补偿组：空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组实验组(FITC+PE组)：悬浮细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组实验组中每组检测两次二、流式样品准备消化：选取第三代处于对数生长期的悬浮细胞球，吸进15ml离心管中离心弃上清，再用0.05%胰蛋白酶消化，消化5min，然后加4mlPBS终止消化。离心：800r/min,离心5min,弃掉上清液3重悬：加2mlPBS重悬，涡旋成单细胞悬液。将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去上清液。加300ulPBS重悬细胞。调补偿组：分别吸取悬浮细胞50ul细胞悬液于四个流式管中(此时细胞数至少为1x106/ml以上)，分成四组，即空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组。实验组((FITC+PE组)：悬浮细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组。实验组中每组检测两次，故每组分别吸取50ul细胞悬液于两个流式管中。空白对照组什么也不加，剩下的每组加相应的抗体10U1。常温避光孵育20min。孵育完成后，加lmlPBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。离心后垂直倒掉上清液，再加200ulPBS重悬细胞，进行上机检测。三、操作注意上机前的细胞最好是单细胞状态，不要粘连，以免对流式细胞仪造成损伤。垂直倒掉上清液后，不要再进行二次倾倒，以免将细胞倒掉。上机检测前，用锡纸把流式管包住，避光。空白对照组和悬浮细胞组加荧光染料前都是无血清培养基+悬浮细胞，只不过一个用于调补偿，一个用于实验检测。悬浮细胞组姜黄素40榄香烯50DMS0组姜黄素40榄香烯50
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