实验4多重序列比对及系统发生树的构建基本信息：姓名：程瑶学号：201378020205班级：医学1301实验日期：2016-05-03实验目的和要求：掌握使用Clustalx进行序列多重比对的操作方法；熟悉构建分子系统发生树的基本过程，掌握使用MEGA软件构建系统发生树的操作方法；进一步熟练BLAST的使用实验仪器、设备与材料：计算机（联网）实验原理：在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化史是一个非常重要的问题。一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化过程的顺序，有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤：=1\*GB2⑴要对所分析的多条目标序列进行比对；=2\*GB2⑵要构建一个进化树（phyligenetictree）；=3\*GB2⑶对进化树进行评估。在实际应用中，多序列比对常用的软件包括ClustalW/X,MUSCLE,MAFFT等，三者的准确性相当，但计算时间依次减少；进化树构建常用的软件包括PHYLIP(软件包，包括多种建树方法），MEGA，MrBayes，Phyml等等。从用户友好性和功能上来说，MEGA是目前用得最多的进化树构建和分析软件。本课程将学习如何使用ClustalX和MEGA分别做多序列比对和进化树构建。实验步骤：1）使用CLUSTALX软件对已知八条DNA序列（如下）进行多重序列比对；M._mulattaAGCTTTCTGGCGCAACCATCCTATGATTGCTCACGGACTCACCTCTTM._fascicuAAGCTTCTCCGGCGCAACCACCTATAATCGCCCGGGCTCACCTCTTM._sylvanuAAGCTTCTCCGGTGCAACTATCCTAGTTGCCATGGACTCACCTCTTHomo_sapieAATTCACCGGCGCAGTCATTCATAATCGCCCACGGGCTTACATCCTGorillaAATTCACCGGCGCAGTTGTTCTTATAATTGCCCACGGACTTACATCATPongoAATCACCGGCGCAACCACCCTCATGATTGCCATGGACTCACATCCTSaimiri_scAAGCTTCCGGCGCAATGATCCTAATAATCGCTCACGGGTTTACTTCGTLemur_cattAAGCTTTAGGAGCAACCATTCTAATAATCGCACATGGCCTTACATCAT使用MEGA软件构建上述DNA分子系统发生树。从BLAST上获取跟人类基因P53同源的其他物种的5个基因，使用MEGA得到它们的分子系统发生树。实验方法：用CLUSTALX软件对已知DNA序列做多序列比对；用MEGA软件推导进化树；用BLAST与MEGA软件推导人基因P53与其他物种中该基因的进化树。作业与思考题：采用以上例子给出的DNA序列进行系统发育树的构建结果。（包括序列比对结果及最终生成的树）A：先把DNA序列做成fasta格式的文件待用：用clustal打开DNA序列，并进行多重对比：BeforealignmentAfteralignment使用MEGA软件构建上述DNA分子系统发生树:OriginaltreeBootstrapconsensustree以上面提供的DNA序列为例，比较Neighbor-joining方法与Maximum-likelihood方法构建进化树的异同，包括涉及的参数，速度与结果等方面；A:①算法思路：Neighbor-joining：最邻近法，是一种利用距离作分子系统分析的方法。先将序列构建一颗星状树，算出总数枝的长度；再将两序列作为聚合群与其他序列分离开来，再算总枝长，合并两个序列使算出的总枝长在各种合并方式中是最短的；将合并的序列作为一个序列再重复上述过程；全部序列合并完后，画出进化树。Maximum-likelihood：最大似然法，是在所有可能的树及所有可能字符替换数方式中，选择可能性最大的一种作为结果。②参数：Neighbor-joining;Maximum-likelihood参数大多还是相同的，主要的不同是phylogenytest和substitutionmodel.然后就是NJ比ML多了treeinferenceoptions和systemresourceusage，ML比NJ多了substitutionstoinclude和patternamonglineages.③速度：根据算法思路，我们知道了用最大似然法(Maximum-likelihood)构建进化树的计算量比最邻近法(Neighbor-joining)要大得多，所以邻近法的速度比最大似然法的速度快。④结果：Neighbor-joining;Maximum-likelihood这两者的结果是相同的，这说明在这两种算法的计算下，这种结果是都是最有可能的，可信度较高。即这种结果，它的总枝长在各种合并方式中是最短的，它也是在所有可能的树及所有可能字符替换数方式中，选择可能性最大的一种结果。在P53相关的实验
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中，对应的蛋白序列改成mRNA序列，然后再做多序列比对与进化树构建，看得到的进化树的异同。A:①我先通过已有的P53蛋白质序列，在BioEdit中转换成mRNA序列；②将所得到的mRNA序列在Clustal中进行多序列比对；③将在Clustal中所得到的FASTA文件在MEGA中打开，并用Neighbor-joining方法构建进化树，如下图：与用蛋白质序列做出的进化树相对比：发现差距很小，基本上都一样，只有一个数据减少了1%。MEGA是目前进化分析领域用的最多的软件之一，请查看其Tutorial，总结其功能，同时思考它能用于哪些方面的研究。A:MEGA的功能还是挺丰富的。例如多序列比对、估计的进化距离、用序列数据去构建进化树、测试所得进化树的可靠性、定义和编辑基因和域、选择测试、定义和编辑分类的组、使用序列数据资源管理器进行计算和统计、从距离数据中构建进化树、构建似然进化树、用最大似然法构建时间进化树等。MEGAhi用来进化分析软件，因此我们应该可以通过大量的数据分析来验证进化假说等。另外，MEGA还内嵌了一个Web浏览器，因此我们应该可以通过网络（NCBI）进行序列的比对和数据的搜索。
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